摘要

有效霉素A(Val-A)是鏈霉菌產生的次級代謝產物，在控制水稻紋枯病、稻曲病和猝倒病方面具有廣泛的農業應用價值。本研究探討了堿性pH沖擊對增強Val-A產量的影響及其機制。通過一次或多次NaOH沖擊處理，結合更快的蛋白質合成和糖消耗，實現了更高的Val-A產量；堿性pH沖擊可使Val-A產量提高27.43%。與氨基酸代謝、碳代謝和電子呼吸鏈相關的基因轉錄顯著上調，同時伴隨著呼吸活性和谷氨酸濃度的大幅增加。Val-A的產量受到一系列復雜機制的促進，并響應pH脅迫信號，這導致了谷氨酸代謝和呼吸活性的增強。所獲得的信息將有助于未來抗生素產量提高的研究以及分子機制的深入揭示。

1.引言

抗真菌抗生素有效霉素A(Val-A)由工業菌株吸水鏈霉菌5008(Streptomyces hygroscopicus 5008)發酵產生，在東亞已被廣泛用作控制水稻紋枯病、稻曲病和猝倒病的首要藥劑。提高Val-A產量的研究備受關注，但似乎對提高生產效率作用有限。pH是微生物代謝的綜合反映，從而影響發酵過程和細胞生長。pH可以影響代謝方向，不同階段生長和產物合成的最適pH也不同。相同的微生物在不同的環境pH條件下可能產生不同的代謝產物。例如，在pH 2-3條件下，黑曲霉（Aspergillus niger）發酵蔗糖的主要產物是檸檬酸，但當pH變為7時，主要產物是草酸(Lu et al.,2016)。因此，在發酵過程中，采用適當的策略控制pH可以獲得所需的產品。

發酵pH對鏈霉菌的發酵也有很大影響，其中一些鏈霉菌具有特定的響應措施。不同抗生素的合成需要不同的pH，即使是同一種抗生素，在不同的培養階段也需要不同的pH才能獲得最高產量。根據Chan的研究(Chan et al.,2015)，提出了一種兩階段pH控制策略，即在培養112小時后將培養pH從5.5調整到5.8，以提高恩拉霉素（enduracidin）的產量，生產效率提高了51.2%。再例如，通過基于原位pH監測的種子階段優化，ε-聚-L-賴氨酸的產量最多提高了36.6%(Sun et al.,2015;Xu et al.,2015)。

環境脅迫一直是促進鏈霉菌次級代謝產物的關鍵方法，環境信號可以通過啟動復雜的轉導系統來提高次級代謝產物的產量(Li et al.,2016)。鏈霉菌基于不同類型的環境因素，具有許多獨特的信號轉導機制。在天藍色鏈霉菌A3(2)(Streptomyces coelicolor A3(2))中，pH沖擊誘導了放線紫紅素（actinorhodin）生產的調控基因和生物合成基因的過表達(Kim et al.,2007,2008)。此外，在鏈霉菌sp.CK4412(Streptomyces sp.CK4412)中，推定的酸沖擊誘導基因SCO7832的表達通過途徑特異性調控基因的過表達刺激了tautomycetin的生產(Park et al.,2009)。此外，雙組分調控系統也是一種非常重要的調控方式。據報道，雙組分系統DraR/DraK參與了天藍色鏈霉菌中抗生素生物合成的調控(Yeo et al.,2013)。在白色鏈霉菌M-Z18(Streptomyces albulus M-Z18)中，研究了高ε-聚-L-賴氨酸生產對酸性pH的生理響應，與轉錄調控、脅迫響應蛋白、轉運蛋白、細胞壁和細胞膜、次級代謝產物生產、DNA和RNA代謝以及核糖體亞基相關的基因在酸性pH響應中起主要作用(Ren et al.,2015)。然而，關于pH沖擊對Val-A產量和生物合成途徑中基因表達影響的信息很少，而這些信息對于改進抗生素發酵和降低成本具有重要價值。直到最近，我們首次采用堿性pH沖擊來增強Val-A的產量，并且初步確定pH沖擊的適宜pH約為8.0(Zhou et al.,2016)。

本研究旨在探討pH沖擊對Val-A發酵過程的影響，并揭示pH與Val-A產量之間的關系。基于吸水鏈霉菌5008在不同pH沖擊條件下合成Val-A的產量變化規律以及最新的基因組研究進展，研究了pH對基因表達的影響及其在生理水平上的規律，以探索pH沖擊提高Val-A產量的機制。首先，選擇pH作為環境脅迫，從代謝活性分析角度提高Val-A產量，并構建了結合pH沖擊的高效發酵策略。此外，依次探討了pH沖擊對基因表達和細胞微環境的影響。最后，全面討論了pH沖擊對Val-A生產的機制。據我們所知，這是在Val-A發酵中采用環境脅迫的首次嘗試。它也可為其他放線菌生產抗生素提供良好的參考。

2.材料與方法

2.1.微生物與發酵條件

所用菌株吸水鏈霉菌5008(Streptomyces hygroscopicus 5008)(CGMCC 4.1026)是工業上Val-A的生產菌株，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

孢子形成瓊脂培養基包含：豆粕20 g/L，麥芽糖20 g/L，瓊脂20 g/L。培養基用2mol/L NaOH調節至pH 7.0，并于121°C高壓滅菌20分鐘。在37°C培養八天后收集孢子，懸浮于20%(v/v)甘油中，并于-80°C保存備用。

種子培養基組成：玉米粉30 g/L，豆粕22 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 2 g/L，KH2PO4 0.8 g/L。接種50μL孢子懸浮液(1.5 x 10?cfu/mL)后，在250mL搖瓶（含50 mL種子培養基）中，于37°C，220 rpm的旋轉搖床上進行預培養。

對于Val-A生產，發酵培養基包含：玉米粉100g/L，豆粕25g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 1g/L，KH2PO4 1.5g/L。將5mL種子培養物接種到含有50 mL發酵培養基的250 mL搖瓶中，在37°C和220 rpm下發酵5天(Zhou,et al.,2012;Zhou and Zhong,2015)。

2.2.提高Val-A產量的pH沖擊策略

2.2.1.不同堿液進行pH沖擊

當發酵進行24小時時，分別向不同處理組的發酵液中加入2 mol/L NaOH、2 mol/L KOH和2 mol/L氨水，將發酵液的pH從自然pH 6.4調整到pH 8.0。

2.2.2.不同時間點進行pH沖擊

六個不同處理組的發酵分別進行4 h、8h、12h、16h、20h和24h，然后向發酵液中加入2 mol/L NaOH將pH調整至pH 8.0，繼續進行培養。

2.2.3.不同處理次數

三組設置如下：

一次pH沖擊處理：當發酵進行20 h時，向發酵液中加入2 mol/L NaOH將pH調整至pH 8.0。

兩次pH沖擊處理：當發酵進行20 h和44 h時，向發酵液中加入2 mol/L NaOH將pH調整至pH 8.0。

三次pH沖擊處理：當發酵進行20 h、44 h和68h時，向發酵液中加入2 mol/L NaOH將pH調整至pH 8.0。

2.3.細胞重量、殘余碳源和Val-A產量的分析

每天取2mL發酵液樣品用于分析細胞重量、殘余碳源和Val-A產量。樣品在12,000g下離心5分鐘。取0.5mL上清液用等體積氯仿萃取，然后用0.22-μm親水性濾膜過濾。含有Val-A的過濾樣品采用高效液相色譜法(HPLC)分析(Iwasa et al.,1971)。由于種子培養基中的玉米粉和豆粕不溶，標準的干重法不可行，因此使用標準的Bradford法測量細胞內蛋白質以反映細胞生長(Kieser et al.,2000)。培養基中的總殘糖作為碳源通過標準的苯酚-硫酸法測定(Liao et al.,2009)。