腫瘤微環境在腫瘤的發生發展中起著重要的作用，該環境具有酸性、低氧和大量免疫抑制性細胞因子等特征。酸性是腫瘤微環境的一個非常顯著的生物學特性，其pH介于5.8～7.4。目前腫瘤微環境的酸性特性已成為抗腫瘤領域研究熱點之一，已經證明改變細胞外酸性微環境能有效影響腫瘤細胞的增殖，例如升高胞外微環境pH能加速腫瘤細胞凋亡和壞死。結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見的惡性腫瘤之一，也是導致死亡率較高的一種癌癥。目前，受益于檢測技術的提高，CRC患者獲得治療的機會增加，CRC患者的復發率以及生存率提高，給腫瘤患者的進一步治療既提供了機會、又提出了挑戰。細胞生物力學特性可以反映細胞結構和功能之間的關系，在機體免疫中具有重要意義。因此，本研究以人體接近的pH7.3作為對照通過觀察不同pH環境對結腸癌CT26細胞生物力學特性的影響，為腫瘤微環境改變對腫瘤影響機制提供依據。


1材料與方法


1.1材料


1.1.1主要試劑小鼠結腸癌CT26細胞(課題組保存)、10%胎牛血清(美國Gibco公司)、RPMI-1640培養基(美國Gibco公司)、鹽酸(無錫亞盛化工有限公司)、氫氧化鈉(美國Sigma公司)、Cell Counting Kit 8(CCK8)、羅丹明標記的鬼筆環肽、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)、Triton-X100(北京索萊寶公司)。


1.1.2主要儀器


臺式低速離心機(上海安亭科學儀器廠)、CO2培養箱(美國Thermo Fisher公司)、細胞電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、F-4600熒光分光光度計(日本Hitachi公司)、激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)、PH微電極（丹麥Unisense公司）。


1.2方法


1.2.1不同pH培養基配置


pH6.5與pH7.8 RPMI-1640培養基分別由鹽酸與氫氧化鈉調節pH7.3 RPMI-1640培養基配制而成。


1.2.2CT26的培養


液氮罐中取出凍存的腸癌CT26細胞，水浴鍋速溶，1 000 r/min離心5 min，去上清，用10%含胎牛血清的RPMI-1640培養基重懸細胞，37℃、5%CO2條件培養。


1.2.3CT26活力檢測

當細胞鋪板面積達約90%時，將CT26分為pH6.5、pH7.3和pH7.8組，分別加入pH6.5、pH7.3與pH7.8條件培養基，96孔板中培養(100μL/孔)24 h，然后向培養板加入CCK-8溶液(10μL/孔)，37℃、5%CO2條件培養2 h，酶標儀450 nm波長下測量每孔吸光度，計算活細胞占總細胞的百分比為細胞活力。


1.2.4CT26電泳遷移率(cell electrophoresisi mobility,EPM)


分別收集pH6.5、pH7.3與pH7.8組的CT26細胞，PBS漂洗、10%蔗糖溶液重懸，將細胞懸液加至細胞電泳小室靜止層中觀察，計算EPM，以此反映細胞表面負電荷量。


1.2.5CT26細胞膜流實驗


分別收集pH6.5、pH7.3與pH7.8條件培養基處理后的CT26細胞，PBS漂洗，無菌避光條件加入DPH 800μL重懸細胞，封口、培養30 min，離心棄上清，PBS洗滌、PBS重懸細胞后用熒光分光光度計測量細胞偏振度參數，按曾柱等方法計算熒光偏振度(P)。P與細胞膜流動性呈負相關。


1.2.6絲狀肌動蛋白(filament actin,F-actin)表達


由F-actin構成的微絲主要通過解聚與聚合來調控細胞形態和遷移能力。分別收集pH6.5、pH7.3與pH7.8組的CT26細胞，4%多聚甲醛固定20 min，吸棄多聚甲醛，PBS漂洗，Triton-100處理，PBS漂洗，羅丹明標記的鬼筆環肽處理，避光12 h，PBS漂洗，加入DAPI、PBS漂洗，加入防熒光淬滅劑油、封片，4℃避光保存備用。共聚焦激光掃描顯微鏡觀察、拍照，Imagej軟件測量細胞熒光值(F-actin表達量)。實驗重復3次，每次實驗每個處理組以隨機方式選擇3個細胞測量熒光值。


1.3統計學分析


2結果


2.1 CT26的細胞活力


pH6.5和pH7.8組的CT26的細胞活力與pH7.3組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1不同pH對CT26活力的影響


2.2 CT26的EPM


與pH7.3組相比，pH6.5組EPM變化不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)；pH7.8組EPM明顯減少,差異有統計學意義(P<0.05)，表明堿性條件pH7.8處理能降低CT26表面的負電荷量。見圖2。

注：(1)與pH7.3組比較，P<0.05。圖2不同pH對CT26細胞EPM的影響


2.3 CT26細胞膜流動性


與pH7.3組CT26細胞的P值相比，pH6.5組變化不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)；pH7.8組P值增加，差異有統計學意義(P<0.05)，說明堿性條件pH7.8處理能降低CT26細胞膜流動性。見圖3。

注：(1)與pH7.3組比較，P<0.05。圖3不同pH對CT26細胞P值的影響


2.4 F-actin的表達


與pH7.3組CT26的F-actin表達相比，pH6.5組F-actin的變化不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)；而pH7.8組CT26中F-actin表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：A圖為熒光圖，B圖統計圖；(1)與pH7.3組比較，P<0.05。圖4不同pH對F-actin表達的影響


3討論


CRC是常見的消化道惡性腫瘤，死亡率較高。在我國，隨著人民飲食結構的改變，特別是高脂肪飲食增加而纖維食物不足的狀況日益嚴重，CRC發病率持續上升。結腸癌由于存在高轉移率特性，使得患者確診后5年生存率很低。因此，找到一種有效的結腸癌治療方法對人類來說具有重大意義。酸性是腫瘤微環境的一個非常顯著的生物學特性，其在腫瘤進展過程中發揮了關鍵作用。目前很多學者已經把改變酸性微環境pH作為腫瘤治療方法來研究。細胞生物力學特性在機體免疫中具有重要意義。因此，本項目以細胞生物力學特性為出發點來研究不同pH對結腸癌CT26細胞功能的影響，為了進一步了解pH在結腸癌治療過程中的作用提供更多理論依據。


細胞生物力學特性能反映細胞結構和功能之間的關系，包括細胞膜電特性、滲透脆性、膜流動性和F-actin等。本文研究不同pH對CT26細胞膜電特性、膜流動性和細胞骨架結構的影響。細胞膜電特性在細胞與細胞間的相互作用中發揮著重要的作用，可用EPM來反映。本實驗結果顯示，堿性條件pH7.8處理能夠抑制CT26的EPM，表明pH7.8能使CT26的表面負電荷減少。人體抗原呈遞細胞表面均帶負電荷。腫瘤免疫中，CT26表面負電荷減少可能導致其與抗原呈遞細胞間的推斥力減少，即堿性條件pH7.8處理可能增加CT26與抗原呈遞細胞的結合作用，這可能有利于抗腫瘤免疫調控。膜流動性是一個重要的細胞生物力學指標，反映細胞膜脂雙層分子運動狀況，與細胞遷移能力相關。堿性條件pH7.8處理能降低CT26的膜流動性，提示結腸癌酸性微環境中增加pH有可能抑制腫瘤細胞膜分子運動。真核細胞骨架主要包括微絲、微管與中間纖維。構成微絲的F-actin在多種結合蛋白的調控下，產生解聚和聚合來調控細胞的形態、偽足形成與遷移。本結果發現，堿性條件pH7.8處理使CT26的F-actin表達減少，提示堿性條件pH7.8可能通過抑制F-actin表達進而調控CT26的遷移。


綜上所述，本研究發現堿性條件pH7.8能抑制CT26的膜負電荷量、膜流動性和F-actin的表達量，而酸性條件pH6.5對這幾種細胞生物力學特性無影響。