Short-term responses of denitrification to chlorothalonil in riparian sediments: Process, mechanism and implication

河岸沉積物中反硝化作用對百菌清的短期響應過程、機制及意義

來源：Chemical Engineering Journal 358 (2019) 1390–1398

 

論文摘要

本研究探討了農藥百菌清（chlorothalonil, CTN）對河岸沉積物反硝化作用的短期影響（48小時）。通過設置不同CTN濃度處理（0、5、10、25 mg/kg），發現高濃度CTN（10和25 mg/kg）顯著降低了沉積物反硝化速率（降幅37-62%），但增加了氧化亞氮（N?O）積累（增幅100-285%）。CTN通過抑制微生物代謝活性（如糖酵解和電子傳輸）和關鍵反硝化酶活性（硝酸鹽還原酶NAR、亞硝酸鹽還原酶NIR、氧化亞氮還原酶NOS），導致反硝化過程受阻和N?O排放增加。短期暴露下，CTN未顯著改變微生物群落結構或反硝化基因豐度，表明其影響主要是功能性的而非結構性的。研究強調河岸CTN積累可能加劇水體富營養化和全球氣候變化。

 

研究目的

 

評估CTN在河岸沉積物中的積累和消散行為：確定CTN殘留水平及其持久性。

探究CTN對沉積物反硝化過程和N?O排放的短期影響：量化反硝化速率和N?O積累的變化。

揭示CTN抑制反硝化的機制：從微生物代謝水平（如電子生產、傳輸和消耗）和酶活性角度闡明作用途徑。

 

評估環境風險：為河岸帶農藥管理提供科學依據，以減輕對水生生態系統和氣候的潛在威脅。

 

研究思路

研究采用“劑量效應實驗-多參數監測-機制驗證”的思路：

 

實驗設計：采集三峽庫區河岸沉積物，設置對照組（0 mg/kg CTN）和三個CTN處理組（5、10、25 mg/kg），在厭氧條件下培養48小時。添加葡萄糖和硝酸鹽作為碳源和氮源。

參數測量：

 

化學分析：監測CTN殘留、營養鹽（NO??、NO??、NH??）濃度、N?O積累。

生物學分析：測量微生物呼吸速率、酶活性（反硝化酶和代謝酶）、代謝物水平（NADH、ATP、丙酮酸）、電子傳輸系統活性（ETSA）。

 

分子分析：通過qPCR量化反硝化基因（narG、nirS、nirK、norB、nosZ）豐度，并通過高通量測序分析微生物群落結構。

 

機制驗證：通過相關性分析 linking 反硝化速率與代謝參數、酶活性和電子流，驗證CTN的抑制途徑。

 

數據整合：結合數值統計和模型，評估CTN的劑量效應和環境意義。

 

測量數據及其研究意義（注明來源）

研究測量了多維度數據，其意義和來源如下：

 

CTN殘留和消散速率：

 

意義：確認CTN在沉積物中的殘留水平（5 mg/kg處理殘留~4 mg/kg，25 mg/kg處理殘留~24 mg/kg）和消散速率（~0.5 mg/kg/d），為劑量效應提供基礎，表明CTN可持久存在并潛在影響微生物過程。

 

來源：數據見圖S2（補充材料）。

 

微生物呼吸速率：

 

基礎呼吸速率：CTN在高濃度（10和25 mg/kg）下顯著降低基礎呼吸（從3.53降至2.10 μmol C kg?1 h?1），表明微生物整體活性受抑制。

底物誘導呼吸速率：類似趨勢，高CTN降低呼吸速率，意義是顯示CTN削弱了微生物對碳源的響應能力，反映代謝功能受損。

 

來源：數據見圖1A和1B。

 

反硝化速率和N?O積累：

 

反硝化速率：CTN在10和25 mg/kg處理下降低反硝化速率37-62%，意義是CTN直接削弱氮去除能力，可能加劇氮污染。

N?O積累：CTN增加N?O排放100-285%，意義是CTN導致反硝化不完全，增加溫室氣體排放，貢獻氣候變化。

 

來源：數據見圖2A和2B。

 

反硝化酶活性：

 

NAR、NIR、NOS活性：CTN顯著抑制這些酶活性（如NOS活性從5.416降至2.075 μmol N g?1 h?1），而NOR活性無變化，意義是CTN特異性影響反硝化鏈的早期和末端步驟，導致NO??和N?O積累。

反硝化基因豐度：無顯著變化，意義是短期暴露下基因表達未受影響，但酶功能被抑制，表明轉錄后或翻譯水平調控。

 

來源：數據見圖3A-D和3E-H。

 

微生物代謝參數：

 

葡萄糖利用和GK活性：無顯著變化，意義是糖酵解初始步驟未受CTN影響。

GAPDH活性、丙酮酸水平、NADH含量、ATP水平：CTN在高濃度下降低這些參數（如NADH從12.14降至4.22 μmol g?1），意義是CTN抑制糖酵解關鍵步驟和能量生產，減少電子供應（NADH）和能量（ATP），直接制約反硝化。

 

來源：數據見圖5A-F。

 

電子傳輸系統活性（ETSA）：

 

ETSA：CTN降低ETSA達43.5%，意義是電子傳輸受阻，影響電子向反硝化酶的傳遞，進一步抑制反硝化。

 

來源：數據見圖6。

 

相關性分析：

 

反硝化速率與代謝參數：與NADH、GAPDH活性、ETSA、NAR、NIR、NOS活性正相關（R2 0.382-0.891），意義是驗證代謝和電子流是反硝化的關鍵驅動因素，CTN通過破壞這些環節抑制反硝化。

 

來源：數據見圖7A-D。

 

微生物群落結構：

 

群落組成：無顯著變化（門和屬水平），意義是短期CTN暴露不引起群落結構改變，影響是功能性的，而非通過物種更替。

 

來源：數據見圖S3（補充材料）。

 

結論

 

劑量依賴性效應：低濃度CTN（5 mg/kg）無顯著影響，但高濃度（10和25 mg/kg）顯著抑制反硝化并增加N?O排放。

機制主導：CTN通過抑制微生物代謝（糖酵解和電子傳輸）和反硝化酶活性（NAR、NIR、NOS）導致反硝化受阻，而非通過改變微生物群落或基因豐度。

 

環境意義：河岸CTN積累可能減少氮去除效率，加劇水體富營養化，并通過增加N?O排放貢獻全球變暖。研究強調需控制農藥流入河岸帶以保護生態系統和氣候。

 

使用丹麥Unisense電極測量數據的研究意義詳細解讀

在本研究中，丹麥Unisense公司的微傳感器系統（MMM-Meter） 被用于測量反硝化酶活性測定中的N?O濃度變化（方法部分2.4節）。具體用于量化NOS（氧化亞氮還原酶）活性，通過監測N?O的消耗速率。

詳細研究意義如下：

 

高精度測量關鍵氣體動態：Unisense微傳感器提供實時、高分辨率的N?O濃度監測，靈敏度達納米級，這對于捕捉反硝化過程中N?O的細微變化至關重要。在NOS活性測定中，它準確記錄了N?O的減少速率，直接反映了NOS酶的功能狀態。

揭示CTN對反硝化末端步驟的影響：數據顯示CTN抑制NOS活性（圖3D），導致N?O積累（圖2B）。Unisense的測量驗證了CTN特異性破壞反硝化鏈的末端還原步驟（N?O→N?），從而增加溫室氣體排放。這提供了機制證據：CTN通過抑制NOS而非NOR（一氧化氮還原酶）導致N?O積累。

支持環境風險評估：Unisense的高可靠性數據量化了N?O排放增幅（100-285%），直接鏈接CTN暴露與氣候變化潛在風險。這強調了河岸農藥污染對全球變暖的貢獻，為政策制定提供科學依據。

 

技術優勢：Unisense傳感器的原位能力和低檢測限避免了采樣擾動，確保了數據準確性。在厭氧條件下測量N?O挑戰性高，但Unisense系統能穩定操作，增強了實驗的可重復性和說服力。

 

綜上所述，Unisense微傳感器獲得的N?O數據，為本研究論證CTN抑制NOS活性并增加N?O排放提供了關鍵、精確的實驗證據，從氣體水平揭示了反硝化不完全的機制，突出了其在環境微生物研究中的價值。