Impacts of chlorothalonil on denitrification and N2O emission in riparian sediments: Microbial metabolism mechanism

百菌清對河岸沉積物反硝化和N2O排放的影響微生物代謝機制

來源：Water Research 148 (2019) 188e197

 

論文摘要

本研究揭示了常用殺菌劑氯硝胺（CTN）在河岸帶沉積物中的積累對氮循環的負面影響。研究發現，CTN會抑制反硝化作用，導致硝酸鹽（NO??）在沉積物中積累，同時顯著增加溫室氣體N2O的排放（增幅達208-377%）。機制研究表明，CTN主要通過抑制反硝化微生物的代謝活性（特別是甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH的活性）和N2O還原酶（NOS）的活性來發揮作用，而非通過影響功能基因（如nosZ）的豐度。這表明，CTN污染會通過干擾微生物的電子生產、傳輸和消耗過程，破壞河岸帶的脫氮功能。

 

研究目的

本研究的主要目的是：

 

探究CTN積累對河岸帶沉積物健康和微生物活性的影響。

明確CTN對河岸帶反硝化過程及其最終產物N2O排放的具體影響。

從微生物代謝機制層面（包括電子產生、傳輸和消耗）揭示CTN影響反硝化作用的深層原理。

 

建立反硝化酶活性與反硝化速率之間的預測模型，識別關鍵控制因子。

 

研究思路

本研究采用了 “野外調查”與“室內控制實驗”相結合的系統研究思路：

 

野外調查：在三峽水庫庫區的河岸帶采集水和沉積物樣本，了解環境背景值，包括CTN的本底濃度。

室內模擬實驗：

 

40天培養實驗：將沉積物暴露于三個濃度的CTN（5, 10, 25 mg kg?1）下，模擬CTN在河岸帶的長期積累效應。

 

60小時厭氧暴露實驗：在上述培養結束后，立即進行短期的厭氧培養，并添加統一的碳源（葡萄糖）和氮源（硝酸鹽），以精確監測CTN對反硝化過程動態的影響。在此實驗中，采用了破壞性采樣策略，在不同時間點取樣，測量各種參數。

 

測量數據及其研究意義（注明來源）

本研究測量了多方面的數據，其意義和來源如下：

 

CTN殘留濃度：

 

意義：確認實驗設計的有效性，明確不同處理組暴露的實際濃度，為劑量-效應關系分析提供基礎。

 

來源：數據見表1。

 

沉積物健康指標（微生物呼吸速率）：

 

意義：反映沉積物中微生物的整體活性。基礎呼吸速率代表原位微生物活性，底物誘導呼吸速率代表微生物的潛在活性。結果表明高濃度CTN對微生物群落產生了毒性壓力。

 

來源：圖1顯示了基礎呼吸和底物誘導呼吸速率。

 

氮轉化與反硝化速率：

 

意義：直接證明CTN對反硝化功能的抑制（NO??和NO??積累，反硝化速率降低）和對環境風險的加劇（N2O排放顯著增加）。這是本研究最核心的發現。

 

來源：NO??、NO??濃度動態和N2O積累量見圖2a和2b；基于1?N同位素配對技術測量的反硝化速率見圖2c。

 

微生物代謝關鍵參數：

 

意義：從機理上解釋反硝化作用被抑制的源頭。研究發現CTN特異性抑制了糖酵解途徑中GAPDH催化的關鍵步驟，導致電子供體（NADH）和能量（ATP）減少，從而限制了整個反硝化過程的電子供應。

 

來源：代謝通路示意圖見圖3a；葡萄糖激酶（GK）和GAPDH活性數據見圖3b和3c；NADH和ATP含量見圖3d和3e。

 

電子傳輸系統（ETS）活性和反硝化酶活性：

 

意義：揭示了電子傳輸和消耗環節如何被CTN破壞。ETS活性下降表明電子傳輸效率降低；四種關鍵反硝化酶（NAR, NIR, NOR, NOS）中，NOS活性受到最顯著的抑制，這直接解釋了為何N2O不能進一步被還原為N2，導致排放增加。

 

來源：電子傳遞鏈示意圖見圖4a；四種反硝化酶活性數據見圖4b-e；ETS活性見圖4f。

 

功能基因豐度和微生物群落結構：

 

意義：通過對比基因水平（DNA） 和酶活性水平（功能表達） 的響應，發現CTN影響的是基因的表達或酶蛋白的功能，而非基因的存在與否。這強調了在評估污染物影響時，僅測量基因豐度可能不夠，必須關注實際的酶活性。群落結構變化表明CTN對特定反硝化菌屬（如假單胞菌屬）有抑制作用。

 

來源：功能基因豐度見圖4g；微生物群落結構（門和屬水平）見圖5a和5b。

 

研究結論

 

主要影響：CTN積累（≥10 mg kg?1）會顯著抑制河岸帶沉積物的反硝化作用，導致硝酸鹽積累，并大幅促進強效溫室氣體N2O的排放。

核心機制：CTN通過干擾反硝化微生物的代謝過程來抑制反硝化作用。具體途徑為：抑制糖酵解中的GAPDH活性 → 減少電子供體NADH的產生 → 削弱電子傳輸系統（ETS） 效率 → 特別是抑制了末端反硝化酶N2O還原酶（NOS） 的活性，阻止N2O被還原為N2。

關鍵因子：NOS酶活性（而非nosZ基因豐度）是調控N2O排放和預測反硝化速率的關鍵因子（結構方程模型結果見圖7）。

 

環境意義：河岸帶中農藥的廣泛存在可能通過上述機制削弱其凈化硝酸鹽污染的能力，并增加其對氣候變化的貢獻，因此需要控制農藥面源污染。

 

使用丹麥Unisense電極測量數據的研究意義詳細解讀

在本文中，丹麥Unisense公司的技術被應用于兩個關鍵環節：

 

測量反硝化酶（NOR和NOS）活性：在方法部分（2.4節）提到，在測定一氧化氮還原酶（NOR）和N2O還原酶（NOS）的活性時，反應中產生或消耗的N2O濃度是使用Unisense的微傳感器檢測的。

 

監測厭氧實驗中的溶解氧（DO）：在好氧-厭氧培養實驗中（2.3節及圖S4提及），使用Unisense的微電極來監測沉積物柱中溶解氧（DO）的動態變化。

 

詳細研究意義如下：

 

實現高精度、原位、實時監測：Unisense微電極以其高空間分辨率（可達微米級）和時間分辨率而聞名。在測量酶活性時，它可以實時、準確地檢測溶液中N2O濃度的微小變化，從而精確計算出NOR和NOS的酶活性。這種精度是傳統離線采樣方法難以比擬的。

確保酶活性測定的準確性：反硝化酶對氧氣高度敏感。在測定過程中，保持嚴格的厭氧環境至關重要。使用Unisense微電極可以實時確認反應體系是否處于所需的厭氧狀態，避免了因氧氣泄漏導致的酶活性測量誤差，保證了數據的可靠性。

驗證實驗條件的穩定性：在長期的厭氧暴露實驗中，通過Unisense溶解氧微電極持續監測DO濃度，研究人員可以確保整個實驗過程中沉積物核心始終處于穩定的厭氧條件。這為觀察到的反硝化動態變化（如NO??減少和N2O積累）是由CTN而非氧氣波動引起的提供了強有力的證據支持。

 

支撐機制研究的深度：正是憑借Unisense電極提供的精確酶活性數據，本研究才能令人信服地得出結論：CTN對N2O排放的促進作用主要是通過抑制NOS酶活性來實現的，而不是通過影響編碼該酶的nosZ基因的豐度。這一發現將機理研究從“基因存在”層面提升到了“功能表達”層面，極大地增強了研究的深度和說服力。

 

綜上所述，使用丹麥Unisense電極的技術為本研究提供了關鍵、可靠的高精度數據，特別是在酶活性和環境因子實時監測方面，為揭示CTN影響反硝化作用的微觀機理提供了不可或缺的技術支撐。