Imaging O2 dynamics and microenvironments in the seagrass leaf phyllosphere with magnetic optical sensor nanoparticles  

利用磁性光學(xué)傳感器納米顆粒成像海草葉際氧氣動態(tài)與微環(huán)境  

來源: The Plant Journal, Volume 104, 2020, Pages 1504-1519

《植物雜志》第104卷，2020年，第1504-1519頁  

 

摘要  

本研究開發(fā)了一種新型磁性光學(xué)傳感器納米顆粒技術(shù)，結(jié)合發(fā)光壽命成像系統(tǒng)，首次實(shí)現(xiàn)了對海草（大葉藻 Zostera marina）葉際復(fù)雜微環(huán)境中氧氣動態(tài)的高分辨率二維成像。研究發(fā)現(xiàn)附生生物膜會形成高度異質(zhì)性的氧氣微環(huán)境：在光照下（300 μmol photons m?2 s?1），葉面氧氣濃度可達(dá)537 μmol L?1（超飽和狀態(tài)）；而在黑暗條件下，厚層附生生物膜（>2 mm）覆蓋區(qū)域會出現(xiàn)局部缺氧甚至厭氧微區(qū)（最低54 μmol L?1）。這種微環(huán)境異質(zhì)性導(dǎo)致海草葉片的光合效率降低（光呼吸增強(qiáng)）并增加厭氧微生物產(chǎn)生還原性有毒物質(zhì)（如H?S）的風(fēng)險。研究還發(fā)現(xiàn)附生生物膜雖然限制了氣體交換，但反而增強(qiáng)了海草內(nèi)部氧氣傳輸效率（較無附生葉片提高7倍），這是由于減少了氧氣向外泄漏。

 

研究目的  

本研究旨在：1）開發(fā)一種基于磁性光學(xué)傳感器納米顆粒的新型成像技術(shù)，用于可視化海草葉際復(fù)雜微環(huán)境中的氧氣動態(tài)分布；2）探究附生生物膜對海草葉片表面氧氣微環(huán)境異質(zhì)性的影響機(jī)制；3）闡明附生生物膜如何影響海草內(nèi)部氧氣傳輸和光合生理過程。

 

研究思路  

1.  納米傳感器制備：將氧敏感熒光染料（PtBP）、天線染料（Fluoreszenzrot）和磁性納米顆粒（EMG1300）封裝在聚苯乙烯-馬來酸酐共聚物（PSMA）基質(zhì)中，制備出粒徑約200 nm的磁性光學(xué)傳感器納米顆粒（圖7）  

 

2.  實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：  

    ? 從丹麥Helsingor海域采集帶有天然附生生物膜的大葉藻葉片樣本  

 

    ? 通過強(qiáng)釹磁鐵將納米顆粒固定于葉片表面（圖7a）  

 

    ? 設(shè)置三種光照條件（0、30、300 μmol photons m?2 s?1）模擬晝夜變化  

 

3.  多維測量技術(shù)結(jié)合：  

    ? 納米顆粒成像：使用發(fā)光壽命成像系統(tǒng)（LLIM）獲取葉際二維氧氣分布（圖1-3）  

 

 

 

 

 

    ? 微傳感器驗(yàn)證：采用Unisense O?微傳感器（OX-50型）測量精確的氧氣微剖面（圖2）  

 

    ? 熒光成像：使用PAM成像系統(tǒng)測定PSII量子產(chǎn)量以評估光合活性（圖5）  

 

4.  數(shù)據(jù)分析：  

    ? 提取區(qū)域（ROI）氧氣統(tǒng)計(jì)量（表1）和線性剖面數(shù)據(jù)（圖3）  

 

    ? 計(jì)算相對內(nèi)部氧氣傳輸率（R = ΔC???/C???）評估附生生物膜對氧氣傳輸?shù)挠绊懀▓D6）

 

測量的數(shù)據(jù)及研究意義  

1.  二維氧氣分布圖像（圖1、2、4）：  

    ? 測量數(shù)據(jù)：通過納米顆粒成像獲得全葉際尺度氧氣濃度空間分布  

 

    ? 研究意義：首次揭示附生生物膜下存在的氧氣微異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)厚層生物膜區(qū)域（>2 mm）在黑暗中出現(xiàn)厭氧微區(qū)（O? < 100 μmol L?1），這為解釋附生生物導(dǎo)致的海草衰退提供了直接證據(jù)——厭氧微環(huán)境促進(jìn)還原性有毒物質(zhì)（如H?S）生成  

 

2.  氧氣微剖面數(shù)據(jù)（圖2、3）：  

    ? 測量數(shù)據(jù)：Unisense微傳感器測量的垂直氧氣梯度顯示，葉面氧氣濃度從黑暗中的54 μmol L?1增至強(qiáng)光下的537 μmol L?1  

 

    ? 研究意義：量化了附生生物膜總擴(kuò)散距離（TDD）對氣體交換的阻礙效應(yīng)，表明厚層生物膜使葉片補(bǔ)償光強(qiáng)升高，增加海草光需求  

 

3.  區(qū)域氧氣統(tǒng)計(jì)量（表1）：  

    ? 測量數(shù)據(jù)：5個ROI的氧氣濃度標(biāo)準(zhǔn)差達(dá)18.8-39.1 μmol L?1  

 

    ? 研究意義：證實(shí)葉際微環(huán)境存在高度空間異質(zhì)性，即使微小區(qū)域（約1 mm2）內(nèi)氧氣條件也可能顯著差異，影響微生物群落分布和活性  

 

4.  相對內(nèi)部氧氣傳輸率（圖6）：  

    ? 測量數(shù)據(jù)：附生葉片內(nèi)部氧氣傳輸率比無附生葉片高7倍（R值比較）  

 

    ? 研究意義：發(fā)現(xiàn)附生生物膜通過減少氧氣外泄反而增強(qiáng)內(nèi)部氧氣傳輸，這一悖論效應(yīng)深化了對植物-附生生物相互作用的認(rèn)知  

 

結(jié)論  

1.  海草葉際存在高度異質(zhì)性的氧氣微環(huán)境，厚層附生生物膜（>2 mm）在黑暗條件下導(dǎo)致局部厭氧區(qū)域，增加還原性有毒物質(zhì)（如H?S）生成風(fēng)險  

2.  附生生物膜雖阻礙氣體交換導(dǎo)致葉面氧氣超飽和（光照下）和缺氧（黑暗下），但通過減少氧氣外泄反而增強(qiáng)內(nèi)部氧氣傳輸效率7倍  

3.  磁性光學(xué)傳感器納米顆粒成像技術(shù)是研究植物-微生物界面化學(xué)微環(huán)境的突破性工具，可實(shí)現(xiàn)高空間分辨率（0.034 mm/像素）的動態(tài)觀測  

4.  海草衰退可能與附生生物膜誘導(dǎo)的葉際微環(huán)境異質(zhì)性直接相關(guān)，未來保護(hù)策略需重點(diǎn)關(guān)注附生生物控制與微環(huán)境調(diào)控

 

使用丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的研究意義  

本研究中使用丹麥Unisense公司的Clark型氧氣微傳感器（OX-50型）進(jìn)行了關(guān)鍵驗(yàn)證測量，其研究意義主要體現(xiàn)在：  

 

1.  提供高精度基準(zhǔn)數(shù)據(jù)：Unisense微傳感器測量了從水體經(jīng)附生生物膜到葉面的精確氧氣微剖面（圖2），為納米顆粒成像數(shù)據(jù)提供了校準(zhǔn)基準(zhǔn)。例如，在葉面位置微傳感器測得43 μmol L?1，與納米顆粒測量的41 μmol L?1高度吻合，驗(yàn)證了新技術(shù)可靠性  

 

2.  解析擴(kuò)散機(jī)制：通過微剖面測量計(jì)算出附生生物膜的總擴(kuò)散距離（TDD=500-1200 μm），首次量化了生物膜對氣體交換的阻礙強(qiáng)度。這一關(guān)鍵參數(shù)揭示了厚層生物膜導(dǎo)致氣體交換效率降低52-39%的物理機(jī)制  

 

3.  揭示代謝熱點(diǎn)：微傳感器在納米顆粒指引下定位測量了化學(xué)熱點(diǎn)區(qū)域（圖4），發(fā)現(xiàn)厭氧微區(qū)與硫酸鹽還原菌活性區(qū)重合，證明附生生物膜下存在活躍的厭氧代謝  

 

4.  互補(bǔ)技術(shù)優(yōu)勢：Unisense微傳感器提供了納米顆粒無法測量的關(guān)鍵參數(shù)——精確的濃度梯度和擴(kuò)散通量。其高達(dá)50 μm的空間分辨率和毫秒級時間分辨率，能夠捕捉納米顆粒成像無法分辨的劇烈梯度變化，為建立生物膜-葉片系統(tǒng)的擴(kuò)散模型提供了輸入?yún)?shù)  

 

Unisense微傳感器在本研究中發(fā)揮了“黃金標(biāo)準(zhǔn)”的作用，其高精度測量不僅驗(yàn)證了新型納米成像技術(shù)的可靠性，更重要的是提供了理解物理擴(kuò)散過程和微生物代謝活動的關(guān)鍵定量數(shù)據(jù)，是完整闡釋海草葉際生物地球化學(xué)過程的不可或缺的技術(shù)支撐。