Calcium-Dependent Hydrogen Peroxide Mediates Hydrogen-Rich Water-Reduced Cadmium Uptake in Plant Roots

鈣依賴性過氧化氫介導(dǎo)富氫水減少植物根系鎘吸收

來源: Plant Physiology, Volume 183, July 2020, Pages 1331–1344

《植物生理學(xué)》第183卷，2020年7月，第1331–1344頁

 

摘要

摘要闡述了氫氣（H2）作為一種可能的信號分子，參與了許多植物發(fā)育和適應(yīng)性反應(yīng)，包括減輕鎘（Cd）從土壤中吸收的有害影響。本研究使用電生理學(xué)和分子生物學(xué)方法，探究了H2如何減輕小白菜（Brassica campestris ssp. chinensis）中的Cd毒性。小白菜根系暴露于Cd后，細(xì)胞內(nèi)H2產(chǎn)量迅速增加。外源施用富氫水（HRW）產(chǎn)生了耐Cd表型，減少了Cd的凈吸收和積累。研究表明，這一過程依賴于鈣離子（Ca2+）跨質(zhì)膜的運(yùn)輸以及由呼吸爆發(fā)氧化酶同系物BcRbohD介導(dǎo)的質(zhì)外體過氧化氫（H2O2）生成。根系Cd吸收的減少與施用外源HRW或H2O2有關(guān)。這種減少效應(yīng)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）的鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（Atirt1）突變體中消失，并且經(jīng)HRW預(yù)處理的小白菜顯示BcIRT1轉(zhuǎn)錄水平降低。暴露于HRW的根系出現(xiàn)快速的Ca2+內(nèi)流，并且Cd誘導(dǎo)的Ca2+外漏得到緩解。兩種Ca2+通道阻斷劑釓離子（Gd3+）和鑭離子（La3+）消除了HRW誘導(dǎo)的BcRbohD表達(dá)增加、H2O2產(chǎn)生以及Cd2+內(nèi)流抑制。總之，研究結(jié)果表明，H2對植物的Cd保護(hù)作用可能通過其控制由RbohD編碼的質(zhì)膜NADPH氧化酶來解釋，該酶在IRT1上游起作用，并在轉(zhuǎn)錄和功能水平上調(diào)節(jié)根系Cd吸收。這些發(fā)現(xiàn)為H2減輕植物中Cd積累和毒性的緩解作用提供了機(jī)制性解釋。

 

研究目的

本研究旨在闡明氫氣（H2）/富氫水（HRW）如何通過信號導(dǎo)導(dǎo)機(jī)制減少植物（以小白菜和擬南芥為模式）根系對鎘（Cd）的吸收和積累，從而緩解Cd毒性的分子和生理機(jī)制。重點(diǎn)探究Ca2+和H2O2信號在此過程中的作用及其與下游Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如IRT1）的調(diào)控關(guān)系。

 

研究思路

1.  表型驗(yàn)證：首先驗(yàn)證Cd脅迫下植物內(nèi)源H2的產(chǎn)生，以及外源HRW處理對Cd脅迫下植物生長、細(xì)胞存活率、Cd吸收積累表型的影響。

2.  生理機(jī)制探索：使用非損傷微測技術(shù)（MIFE）測量根系關(guān)鍵位點(diǎn)（伸長區(qū)和成熟區(qū)）的Cd2+、Ca2+、H+、H2O2等離子/分子的實(shí)時(shí)凈流速變化，明確HRW對Cd2+內(nèi)流的抑制作用。

3.  分子機(jī)制探索：

    a.  通過qRT-PCR分析HRW及Cd處理對關(guān)鍵基因（BcIRT1, BcZIP2, BcRbohD, BcRbohF）表達(dá)水平的影響。

    b.  使用藥理學(xué)抑制劑（DPI抑制NADPH氧化酶，Gd3+/La3+抑制Ca2+通道）干擾潛在信號通路，觀察對H2O2產(chǎn)生、基因表達(dá)及Cd吸收的影響。

    c.  利用擬南芥突變體（AtrbohD, AtrbohF, Atirt1）進(jìn)行遺傳學(xué)驗(yàn)證，確認(rèn)RbohD和IRT1在HRW介導(dǎo)的Cd吸收減少中的必要性。

4.  信號整合：綜合所有數(shù)據(jù)，構(gòu)建從H2信號感知到Ca2+內(nèi)流，激活RbohD產(chǎn)生H2O2，進(jìn)而抑制IRT1介導(dǎo)的Cd2+內(nèi)流的信號導(dǎo)導(dǎo)模型。

 

測量的數(shù)據(jù)及研究意義

1.  內(nèi)源H2釋放和含量（圖1）：使用Unisense H2微傳感器和氣相色譜（GC）測量。研究意義：證實(shí)Cd脅迫能快速、持續(xù)地誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生H2，提示H2可能作為響應(yīng)Cd脅迫的早期信號分子。

 

2.  表型與細(xì)胞存活率（圖2）：測量根長、鮮重及FDA-PI熒光染色評估細(xì)胞存活率。研究意義：證明外源HRW處理能顯著緩解Cd抑制的生長并減少Cd引起的根尖細(xì)胞死亡，表明HRW具有保護(hù)作用。

 

3.  凈離子流速（圖3, 圖6, 圖7, 圖8, 圖9, 圖10C）：使用MIFE系統(tǒng)測量Cd2+、Ca2+、H+、H2O2的凈流速。研究意義：直接證明HRW預(yù)處理能顯著抑制Cd2+的內(nèi)流；揭示了HRW能引發(fā)快速的Ca2+內(nèi)流并緩解Cd引起的Ca2+外漏；顯示了HRW誘導(dǎo)的H2O2外流；證明了Rboh和IRT1突變體對HRW效應(yīng)的喪失，從功能上驗(yàn)證了這些組分在信號通路中的關(guān)鍵作用。

 

 

 

 

 

 

4.  Cd含量積累（圖4A,B; 圖10D）：使用原子吸收光譜法測量植物組織Cd含量。研究意義：證實(shí)HRW處理降低了根系和地上部的Cd積累量，與流速數(shù)據(jù)一致，表明其效應(yīng)是生理相關(guān)的。

 

5.  基因表達(dá)水平（圖4C,D; 圖5E,F; 圖10A,B,E）：通過qRT-PCR分析BcIRT1, BcZIP2, BcRbohD, BcRbohF的轉(zhuǎn)錄本豐度。研究意義：表明HRW通過下調(diào)Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BcIRT1的轉(zhuǎn)錄來減少Cd吸收；揭示了HRW快速上調(diào)BcRbohD的表達(dá)，且該過程受Ca2+信號調(diào)控。

 

6.  H2O2和Ca2+熒光成像（圖5C,D; 圖9A,B,E,F inset）：使用H2DCFDA和Fluo-3/AM熒光探針進(jìn)行化學(xué)染色和成像。研究意義：直觀地顯示了HRW和Cd處理對根內(nèi)H2O2積累和Ca2+水平的影響，與微電極測量的流速數(shù)據(jù)相互印證。

7.  組織Ca含量：測量根組織Ca濃度。研究意義：證實(shí)HRW緩解了Cd引起的根內(nèi)Ca流失，且該效應(yīng)被Ca2+通道抑制劑阻斷，支持Ca2+流入的作用。

 

結(jié)論

1.  Cd脅迫能迅速誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生氫氣（H2）。

2.  外源施用富氫水（HRW）能有效緩解Cd脅迫對植物生長的抑制，減少根系對Cd2+的吸收和積累，并提高根尖細(xì)胞的存活率。

3.  HRW減少Cd吸收的效應(yīng)依賴于一個(gè)信號導(dǎo)導(dǎo)通路：HRW首先引起快速的Ca2+內(nèi)流；升高的胞內(nèi)Ca2+激活質(zhì)膜上的NADPH氧化酶（主要由RbohD編碼），導(dǎo)致質(zhì)外體H2O2產(chǎn)生；H2O2作為信號分子，下調(diào)編碼Cd主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的BcIRT1基因的表達(dá)，并抑制其功能活性，最終減少Cd2+的內(nèi)流。

4.  該信號通路的各個(gè)環(huán)節(jié)（Ca2+內(nèi)流、RbohD激活、H2O2產(chǎn)生、IRT1抑制）均通過藥理學(xué)抑制劑和遺傳突變體實(shí)驗(yàn)得到了驗(yàn)證。

5.  本研究揭示了H2作為一種氣體信號分子，通過Ca2+-H2O2信號模塊調(diào)控下游轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)和功能，從而減少Cd吸收的新機(jī)制，為利用HRW降低農(nóng)作物Cd積累提供了理論基礎(chǔ)。

 

使用丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的研究意義

本研究中使用丹麥Unisense公司的產(chǎn)品進(jìn)行了兩項(xiàng)關(guān)鍵測量，其研究意義至關(guān)重要：

1.  H2微傳感器（Needle-type hydrogen sensor）：用于實(shí)時(shí)監(jiān)測葉片組織中的H2釋放動(dòng)態(tài)（圖1A）。研究意義：這項(xiàng)測量提供了直接證據(jù)，證明Cd脅迫能夠迅速（在300秒內(nèi)）觸發(fā)植物體內(nèi)H2的生成。這種高時(shí)間分辨率的原位測量技術(shù)，能夠捕捉到傳統(tǒng)方法（如氣相色譜）難以發(fā)現(xiàn)的早期、快速的H2信號變化。它首次將Cd脅迫與內(nèi)源H2的產(chǎn)生直接、動(dòng)態(tài)地聯(lián)系起來，確立了H2作為響應(yīng)Cd脅迫的早期信號分子的地位，為整個(gè)研究的立論奠定了基礎(chǔ)。

2.  H2O2微電極（H2O2-sensitive microelectrode）：用于測量根系質(zhì)外體H2O2的凈流速（圖5A, B）。研究意義：與熒光染色（顯示積累量）不同，微電極能夠非損傷、實(shí)時(shí)地監(jiān)測H2O2在根表界的動(dòng)態(tài)流動(dòng)（flux）。這些數(shù)據(jù)清晰地顯示，HRW預(yù)處理能誘導(dǎo)H2O2的外排（efflux），并且這種外排在Cd刺激后進(jìn)一步增強(qiáng)。這提供了功能性的證據(jù)，表明HRW確實(shí)激活了質(zhì)膜上產(chǎn)生H2O2的機(jī)制（如NADPH氧化酶），并將H2O2釋放到質(zhì)外體空間發(fā)揮作用。這些實(shí)時(shí)流速數(shù)據(jù)與藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)（DPI抑制）、基因表達(dá)分析（BcRbohD上調(diào)）以及突變體表型（AtrbohD無效）完美結(jié)合，共同且強(qiáng)有力地證明了RbohD介導(dǎo)的H2O2產(chǎn)生是HRW抑制Cd吸收的關(guān)鍵中間步驟。

 

總之，Unisense微傳感器提供的高時(shí)間分辨率和原位實(shí)時(shí)監(jiān)測能力，使得研究者能夠精確地捕捉到H2和H2O2這兩種關(guān)鍵信號分子在應(yīng)激反應(yīng)初期的瞬時(shí)動(dòng)態(tài)變化。這些數(shù)據(jù)不僅是簡單的濃度記錄，更是揭示信號通路啟動(dòng)順序和因果關(guān)系的核心證據(jù)，將H2信號的產(chǎn)生、Ca2+的響應(yīng)、H2O2的生成以及最終的Cd2+流入抑制串聯(lián)成一個(gè)清晰、可信的因果鏈條，極大地增強(qiáng)了對H2調(diào)控Cd吸收機(jī)制理解的深度和可靠性。