External α-carbonic anhydrase and solute carrier 4 (SLC4) are required for HCO?? uptake in a freshwater angiosperm  

淡水被子植物吸收HCO??需要外部α-碳酸酐酶和溶質載體4（SLC4）  

來源：Journal of Experimental Botany, Volume 71, Issue 19, 2020, Pages 6004–6014 

《實驗植物學雜志》，第71卷，第19期，2020年，頁碼6004–6014

 

摘要  

淡水單子葉植物水車前（Ottelia alismoides）是已知唯一能操作三種CO?濃縮機制（CCMs）的物種：組成型HCO??利用和C4光合作用，以及兼性景天酸代謝（CAM），但其HCO??利用機制未知。本研究發現，陰離子交換（AE）蛋白抑制劑DIDS阻止了HCO??利用，也對CO?吸收有輕微影響。外部碳酸酐酶（CA）抑制劑乙酰唑胺（AZ）降低了CO?吸收的親和力，也通過影響AE蛋白阻止了HCO??利用。mRNA轉錄本分析鑒定出負責HCO??轉運的溶質載體4（SLC4）同源物（可能是DIDS的靶點）和一個周質的α-CA1。通過模型量化三種不同無機碳（Ci）吸收途徑的貢獻表明，在高CO?濃度下，被動CO?擴散主導Ci吸收。然而，隨著CO?濃度降低，另外兩種途徑變得主導：由α-CA1在質膜上將HCO??轉化為CO?，以及由SLC4轉運HCO??穿過質膜。這些機制使得該物種能夠利用無機碳庫中更大部分，并在生產力高的生態系統中碳嚴重耗盡時期持續進行光合作用。

 

研究目的  

本研究旨在揭示淡水水生植物水車前（Ottelia alismoides）利用碳酸氫根（HCO??）進行光合作用的具體分子機制。重點探究外部碳酸酐酶（CAext）和陰離子交換蛋白（如SLC4家族成員）是否以及如何參與HCO??的吸收過程，并量化在不同CO?濃度下，被動CO?擴散、CA介導的HCO??轉化和直接HCO??轉運這三種途徑對總無機碳（Ci）吸收的相對貢獻。

 

研究思路  

1.  生理實驗（pH漂移與抑制劑）：利用pH漂移技術，在密閉系統中監測水車前葉片光合作用引起的pH變化和Ci消耗，以評估其HCO??利用能力。在實驗中分別加入特異性抑制劑：乙酰唑胺（AZ，抑制外部碳酸酐酶CAext）和DIDS（抑制陰離子交換蛋白AE/SLC4），觀察它們對Ci吸收動力學、最終pH、CO?補償點等參數的影響，以判斷這兩種機制的作用。

2.  酶活檢測：直接測量葉片外部碳酸酐酶（CAext）的活性，并驗證AZ和DIDS對其活性的影響。

3.  分子生物學分析（轉錄組學）：對適應高CO?（HC）和低CO?（LC）條件的水車前葉片進行轉錄組測序（包括二代和三代測序），鑒定與Ci吸收相關的關鍵基因轉錄本，特別是編碼α-碳酸酐酶（α-CA）和SLC4家族HCO??轉運蛋白的基因，并分析其表達量在不同CO?條件下的差異。

4.  建模與量化：基于抑制劑實驗獲得的數據，建立一個模型來量化并解析三種Ci吸收途徑（CO?被動擴散、CAext介導的HCO??轉化、SLC4介導的HCO??直接轉運）在不同溶解CO?濃度下的相對貢獻率。

 

測量的數據及研究意義  

1.  pH漂移終點參數（來自圖1）：測量了對照組和抑制劑（AZ, DIDS）處理組的最終pH值（圖1A）、最終CO?濃度（圖1B）。該數據直接證明了水車前具有強大的HCO??利用能力（對照組最終pH極高，CO?極低），而AZ和DIDS處理均抑制了這種能力，表明CAext和AE蛋白是HCO??利用所必需的。

 

2.  Ci吸收動力學參數（來自圖1C, D, E；圖2）：計算了Ci吸收速率對CO?濃度的初始斜率（反映親和力，圖1C）、CO?補償點（圖1D）、以及Ci/堿度比值（反映對Ci庫的利用效率，圖1E）。圖2展示了不同CO?濃度下的Ci吸收速率及抑制率。這些數據揭示了AZ和DIDS如何特異性影響Ci吸收的不同環節（如AZ顯著降低吸收親和力并提高補償點），為區分三種吸收途徑提供了關鍵動力學依據。

 

3.  CAext酶活性數據（來自圖4C, D）：直接測量了葉片CAext的活性（圖4C）以及AZ和DIDS對活性的抑制效果（圖4D）。該數據從生化水平證實了CAext的存在及其對AZ的敏感性，而DIDS不抑制CAext活性，表明兩者作用靶點不同。

 

4.  基因表達數據（來自圖5）：通過轉錄組學分析，獲得了編碼α-CA1（圖5A）和SLC4轉運蛋白（圖5B）的基因轉錄本表達量（RPKM/FPKM）。該數據從分子水平證實了這些關鍵基因的存在，并且它們的表達在不同CO?條件下（HC vs LC）沒有顯著差異，與水車前“組成型”HCO??利用能力的生理現象相一致。

 

5.  抑制劑可逆性驗證數據（來自圖3）：通過清洗去除AZ后，Ci吸收速率得以恢復。該數據證明了AZ的作用是可逆的，且其作用靶點位于細胞外部（無法進入細胞），排除了其對內部酶的非特異性抑制，強有力地支持了CAext是其主要作用靶點。

 

結論  

1.  水車前（Ottelia alismoides）利用HCO??依賴于兩種關鍵機制：位于質膜外部的α-碳酸酐酶1（α-CA1）將HCO??催化脫水生成CO?以供擴散吸收，以及溶質載體4（SLC4）家族蛋白直接轉運HCO??進入細胞。

2.  這兩種機制是“組成型”表達的，其基因轉錄水平和功能活性不受環境CO?濃度（高或低）的顯著誘導或抑制。

3.  三種Ci吸收途徑的貢獻隨環境CO?濃度動態變化：在高CO?條件下（~50μM），被動CO?擴散是主要途徑（貢獻~55.7%）；隨著CO?降低至近空氣平衡值（~9μM），CAext介導的途徑成為主導（貢獻~64.4%）；當CO?濃度極低（~1μM）時，被動擴散失效，CAext和SLC4介導的途徑共同支撐Ci吸收（各貢獻約50%）。

4.  該研究首次在淡水水生被子植物中提供了SLC4家族HCO??轉運蛋白參與Ci吸收的直接分子和生理證據，深化了對水生植物碳濃縮機制多樣性的理解。

 

使用丹麥Unisense電極測量數據的研究意義  

在本研究的pH漂移實驗中，使用了丹麥Unisense公司生產的氧敏感微電極（Oxygen electrode, model OX-13298）與Unisense微傳感器多功能表（Unisense microsensor multimeter）相連，用于監測反應室中的溶解氧（O?）濃度。其研究意義在于：

1.  控制實驗條件：在pH漂移實驗開始時，通過向反應室充入氮氣（N?），將初始溶解氧濃度降低并穩定在約100 μM（約為空氣飽和度的40%）。精確控制氧分壓至關重要，因為氧氣是光合作用的競爭性底物，其濃度會影響Rubisco酶的活性（催化羧化與加氧反應），從而影響測得的CO?補償點和Ci吸收動力學參數的準確性。

2.  確保數據可靠性：通過實時監測并維持較低且穩定的O?水平，可以最大限度地減少光呼吸作用的影響，確保觀察到的pH變化和Ci消耗 primarily 是由光合碳固定驅動的，從而使得基于pH漂移數據計算的Ci吸收速率、CO?補償點等關鍵參數更能真實反映CCM的運行效率，提高了實驗結果的可靠性和準確性。

3.  技術優勢：Unisense氧電極具有高靈敏度和快速響應時間，能夠實時、連續、精確地監測微小反應體系中溶解氧的微小變化，這是傳統離線采樣方法無法實現的，為精細調控實驗環境提供了關鍵的技術支持。

 

綜上所述，Unisense氧電極的應用并非直接測量碳代謝參數，而是通過精確控制和分析實驗中的氧環境這一關鍵變量，為準確解析水車前無機碳吸收機制提供了必要且可靠的實驗條件保障。