Semiquantitative Detection of Hydrogen-Associated or Hydrogen-Free Electron Transfer within Methanogenic Biofilm of Microbial Electrosynthesis

 微生物電合成產甲烷生物膜內氫關聯或無氫電子轉移的半定量檢測

來源: Applied and Environmental Microbiology, Volume 86, Issue 17, September 2020, Article ID e01056-20

《應用與環境微生物學》第86卷第17期，2020年9月，文章編號 e01056-20

 

摘要

闡述了在厭氧環境（特別是微生物電合成系統MES）中，氫糾纏的電子轉移是共享還原當量以調節生物膜活性的重要胞外途徑。然而，由于缺乏有效的陰極生物膜原位氫檢測方法，氫在電子轉移中的作用仍存在爭議。本研究在產CH4的MES反應器中構建了陰極生物膜，通過分析氫析出動態證實了陰極微米尺度內存在氫關聯的電子轉移。FISH圖像顯示陰極58.10 μm厚的生物膜內形成了古菌和細菌的共定位群落，表明微傳感器檢測到的氫梯度被細菌和古菌的協作所消耗。微傳感器與循環伏安法測試相結合，進一步提供了氫關聯途徑對甲烷生成貢獻的半定量結果（在-0.5 V至-0.69 V電位下約為21.20% ± 1.57%）。該發現為導電材料上生物膜的電子轉移機制提供了深刻見解。

 

研究目的

本研究旨在闡明在混合培養的產甲烷陰極生物膜中，電子從電極到微生物的轉移途徑（是氫關聯的還是無氫的）以及氫在其中所扮演的角色和貢獻程度，以解決當前關于陰極生物膜中電子轉移機制的爭議。

 

研究思路

1.  構建產甲烷的微生物電合成系統反應器，培養成熟的陰極生物膜。

2.  使用丹麥Unisense氫微電極傳感器原位測量陰極表面及附近生物膜內的氫濃度梯度分布。

3.  通過熒光原位雜交技術分析生物膜的厚度、結構以及微生物群落（細菌和古菌）的空間分布和共定位情況。

4.  結合微傳感器與循環伏安法，在不同陰極電位下同步測量氫濃度和電流的變化，對比有生物膜（ biotic）和無生物膜（abiotic）條件下的差異。

5.  基于對比數據，半定量計算氫關聯電子轉移對總電子轉移和甲烷生成的貢獻比例。

6.  在不同外加電壓下運行反應器，檢測甲烷和氫氣的產量，分析電位對這兩種途徑的影響。

7.  通過16S rRNA基因測序分析生物膜的微生物群落組成和功能預測。

 

測量的數據及研究意義

1.  陰極附近不同距離的氫濃度梯度（來自圖1）：研究意義在于直接證明了陰極表面產生了氫氣，并且其濃度隨著遠離電極表面而降低，特別是在生物膜厚度范圍內（約100μm內）出現急劇下降，表明生物膜 actively 消耗了氫氣。

 

2.  生物膜的熒光原位雜交圖像和厚度測量（來自圖2）、微生物群落組成（來自圖2f）：研究意義在于確定了生物膜的物理結構和微生物的空間分布（古菌和細菌共定位），并明確了群落以產甲烷菌為主，包含多種功能菌群（如發酵菌），為理解氫的潛在消費者和可能的種間電子轉移模式提供了微生物學背景。

 

3.  有生物膜和無生物膜條件下，循環伏安掃描過程中的氫濃度和電流動態變化（來自圖3）：研究意義在于對比顯示了生物膜的存在顯著降低了檢測到的氫濃度，改變了氫析出的起始電位，證明了微生物對氫的消耗作用，并反映了生物膜對陰極電化學過程的整體影響。

 

4.  不同陰極電位下標準化（除以電流）后的氫濃度（有生物膜 vs 無生物膜）及其比值（來自圖4）：研究意義在于消除了電流大小的影響，直接比較了相同電流下氫的實際產量差異，從而為計算氫關聯途徑的電子分流比例提供了關鍵數據。

 

5.  不同外加電壓（對應不同陰極電位）下的甲烷產量、氫氣產量、電流以及摩爾電子產甲烷率（來自圖5a）：研究意義在于展示了操作電位對兩種電子轉移途徑的相對重要性的調控作用，表明更負的電位有利于氫產生但可能降低甲烷轉化的電子效率。

 

6.  多次循環伏安掃描中氫濃度的衰減情況（來自圖5c）：研究意義在于顯示了生物膜消耗氫氣的活性需要一定的激活時間，并表明微生物消耗氫的能力存在上限。

 

結論

1.  氫確實是混合培養陰極產甲烷生物膜中電子轉移的重要介質，存在氫關聯的電子轉移途徑。

2.  生物膜內的微生物（細菌和古菌）協作消耗了在陰極產生的氫氣。

3.  氫關聯的電子轉移并非主導途徑。在測試的電位范圍內（-0.5 V 至 -0.69 V vs RHE），僅有約21.20% ± 1.57% 的電子用于通過產氫進而貢獻甲烷生成，大部分電子通過無氫途徑直接轉移給微生物。

4.  陰極電位顯著影響氫氣和甲烷的產量。更負的電位產生更多氫氣，但可能降低電子流向甲烷的比例。

5.  生物膜群落組成復雜，以產甲烷菌為主，包含發酵菌等，支持了多種可能的 syntrophic 相互作用（發酵-產甲烷菌、產乙酸-產甲烷菌模型）。

 

使用丹麥unisense電極測量數據的研究意義

1.  實現了原位和高分辨率測量：傳統方法難以在不妨礙生物膜結構和功能的情況下，對這類薄而脆弱的生物膜內部的化學梯度進行測量。Unisense氫微電極尺寸極小，能夠精確地、微米級地步進穿透生物膜或貼近電極表面，從而實現了對陰極生物膜內部及電極-溶液界面氫濃度時空變化的原位、實時、高分辨率測量（如圖1所示）。這避免了破壞樣品或使用間接方法可能帶來的誤差。

2.  直接證實了氫氣的產生和消耗：測量到的氫濃度梯度（從電極表面最高值向溶液方向遞減）直接證明了陰極析氫反應的發生。更重要的是，在生物膜存在時，氫濃度在緊貼電極表面的生物膜區域內急劇下降，這提供了氫氣被生物膜微生物快速消耗的直接證據，強有力地支持了“氫作為電子載體被微生物利用”的假設。

3.  揭示了生物膜的空間功能結構：通過將氫濃度分布與FISH確定的生物膜厚度和微生物空間分布相結合，可以將化學活動（氫消耗）與微生物位置聯系起來。數據顯示最劇烈的氫消耗發生在約100μm范圍內，恰好與生物膜厚度和細菌/古菌共定位區域吻合， suggesting 這個區域是氫營養代謝的活躍區，揭示了生物膜內代謝活動的空間異質性。

4.  為半定量分析提供了關鍵數據：通過與循環伏安法聯用（MS-CV），微傳感器能夠在受控的、變化的電位下同步監測氫濃度的瞬時變化。通過對比有/無生物膜條件下，相同電流時氫產量的差異（圖3, 圖4），研究者能夠量化被微生物“截留”消耗掉的那部分氫氣所對應的電子量。這直接導致了研究的核心發現——對氫關聯電子轉移貢獻率的半定量估算（約21%）。沒有微傳感器提供的精確氫濃度數據，這種基于電位掃描的動態半定量分析是無法實現的。

5.  提供了對生物膜代謝活性的洞察：多次CV掃描中氫濃度衰減的動態（圖5c）反映了生物膜微生物群落對氫消耗的響應時間和活性上限，提供了對生物膜代謝狀態和適應性的見解。

 

總而言之，Unisense微傳感器的使用使研究者能夠超越間接推測，直接“看到”和“量化”生物膜內部關鍵的化學物質（氫氣）的動態過程，將電化學信號、化學梯度與微生物活動精確地關聯起來，從而為理解復雜生物膜系統中的電子轉移機制提供了前所未有的細節和證據力度。這是本研究的 methodological 核心和創新點所在。