Lectin-induced oxidative stress in human platelets

凝集素誘導的人血小板氧化應(yīng)激

來源：Redox Biology 32 (2020) 101456

 

1. 論文摘要核心內(nèi)容

 

本研究首次揭示 小麥胚芽凝集素（WGA） 和 菜豆凝集素（PHA） 通過雙重機制誘導血小板氧化應(yīng)激：

 

氧化損傷：WGA和PHA顯著增加活性氧（ROS）、超氧陰離子（O??）和脂質(zhì)過氧化水平（圖1-3），降低谷胱甘肽（GSH）和膜SH基團含量（圖4），而羽扇豆凝集素（LCA）無效。

 

 

 

 

代謝解偶聯(lián)：WGA和PHA作為解偶聯(lián)劑，增加氧耗但減少ATP合成，降低P/O值（氧化磷酸化效率）（圖6），破壞線粒體膜電位（圖8）。

 

 

信號機制：NADPH氧化酶1（Nox1）、syk和PI3K通路參與介導氧化應(yīng)激（圖1C, 2C, 3C, 5B, 9）。

 

 

細胞毒性：凝集素降低血小板糖酵解活性并增加乳酸脫氫酶釋放，提示細胞損傷（圖10）。

 

 

WGA的效應(yīng)始終強于PHA，且其作用與血小板激活的data-original/syk和PI3K/BTK通路相關(guān)（與前期研究一致）。

 

2. 研究目的

 

1.探究 WGA、PHA和LCA 對血小板氧化應(yīng)激標志物（ROS、O??、脂質(zhì)過氧化）的影響。

2.闡明凝集素對血小板 需氧代謝（氧耗、ATP合成、P/O值）的調(diào)控作用。

3.驗證 NADPH氧化酶（Nox）及syk/PI3K通路 在凝集素誘導氧化應(yīng)激中的角色。

 

3. 研究思路

 

1.血小板處理：

 

洗滌血小板分別用WGA、PHA、LCA（濃度梯度：1–50 μg/mL；時間梯度：5–30 min）刺激。

 

抑制劑預(yù)處理：DTT（二硫鍵還原劑）、DPI（Nox抑制劑）、2-TFP（Nox1特異性抑制劑）、PP2（data-original抑制劑）、LY294002（PI3K抑制劑）等（圖1C, 2C, 3C）。

2.氧化應(yīng)激指標檢測：

 

ROS：DCFH-DA熒光探針結(jié)合流式細胞術(shù)（圖1）。

 

超氧陰離子：細胞色素C還原法（SOD可抑制）（圖2）。

 

脂質(zhì)過氧化：硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）測定（圖3）。

 

抗氧化系統(tǒng)：GSH和膜SH基團定量（圖4）。

3.代謝功能評估：

 

氧消耗：丹麥Unisense O?電極實時監(jiān)測（圖6-7）。

 

 

ATP合成：熒光素酶生物發(fā)光法（圖6）。

 

膜電位：TMRM熒光探針結(jié)合流式細胞術(shù)（圖8）。

4.機制驗證：

 

Nox活性：細胞色素C還原法（圖5）。

 

通路抑制：syk/PI3K抑制劑對代謝參數(shù)的影響（圖9）。

 

4. 關(guān)鍵數(shù)據(jù)及研究意義

(1) 氧化應(yīng)激指標（圖1-5）

 

 

數(shù)據(jù)：

 

ROS：WGA（10 μg/mL）使DCF熒光升高 >4倍（圖1A），PHA效果較弱（≈2倍），LCA無效。

 

超氧陰離子：WGA誘導的O??生成被DPI抑制80%（圖2C），證實Nox主導作用。

 

脂質(zhì)過氧化：WGA使TBARS增加 3.5倍（圖3A），2-TFP抑制60%（圖3C），提示Nox1為核心貢獻者。

 

意義：首次證明 凝集素通過Nox1依賴途徑觸發(fā)血小板氧化損傷，為心血管疾病中血小板異常激活提供分子機制。

 

(2) 代謝功能紊亂（圖6-9）

 

 

數(shù)據(jù)：

 

氧消耗：WGA（10 μg/mL）使氧耗增加 ≈40%（丙酮酸/蘋果酸供能）（圖6A），Unisense電極實時追蹤顯示動態(tài)上升（圖7）。

 

ATP合成：WGA使ATP產(chǎn)量下降 >50%（圖6B），P/O值從2.5降至1.2（圖6C），提示解偶聯(lián)效應(yīng)。

 

膜電位：WGA使TMRM熒光降低 30%（圖8），證實線粒體功能受損。

 

意義：凝集素通過 破壞氧化磷酸化耦合 降低血小板能量儲備，揭示其促血栓形成的代謝基礎(chǔ)。

 

(3) 信號通路機制（圖1C, 2C, 3C, 9）

 

 

數(shù)據(jù)：

 

Nox1依賴：2-TFP抑制WGA誘導的氧耗增加60%（圖9A）。

 

syk/PI3K參與：LY294002（PI3K抑制劑）和Piceatannol（syk抑制劑）部分逆轉(zhuǎn)代謝異常（圖9）。

 

意義：確立 Nox1-syk-PI3K軸 為凝集素誘導氧化應(yīng)激的核心通路，為靶向干預(yù)提供新靶點。

 

(4) 細胞毒性（圖10）

 

 

數(shù)據(jù)：WGA使乳酸脫氫酶釋放增加 3倍（圖10C），乳酸生成減少 70%（圖10A），提示細胞膜損傷和代謝衰竭。

 

意義：凝集素通過氧化應(yīng)激和能量耗竭 推動血小板走向死亡，可能加劇炎癥性血管損傷。

 

5. 結(jié)論

 

1.WGA和PHA為強效氧化應(yīng)激誘導劑：通過激活Nox1和syk/PI3K通路，升高ROS、O??及脂質(zhì)過氧化水平，耗竭抗氧化系統(tǒng)（GSH/SH基團）。

2.代謝解偶聯(lián)是核心毒性機制：凝集素破壞線粒體耦合效率（↑氧耗、↓ATP合成），降低P/O值，削弱血小板能量穩(wěn)態(tài)。

3.病理相關(guān)性：WGA/PHA的促氧化和代謝紊亂效應(yīng)可能參與 血栓形成 和 炎癥性血管疾病（如動脈粥樣硬化）。

 

6. 丹麥Unisense電極的核心價值

(1) 技術(shù)突破性應(yīng)用

 

 

實時動態(tài)監(jiān)測氧代謝：

 

采用 Unisense O?微電極（方法2.2.7）直接測量血小板懸液氧消耗（圖6-7），突破傳統(tǒng)終點法局限。

 

關(guān)鍵數(shù)據(jù)：WGA刺激后氧耗速率從 5.2→7.3 nmol O?/min/mg（圖6A），F(xiàn)CCP（解偶聯(lián)劑陽性對照）效應(yīng)相似（圖7）。

 

(2) 關(guān)鍵科學貢獻

 

 

精準量化解偶聯(lián)效應(yīng)：

 

Unisense數(shù)據(jù)直接捕捉 凝集素誘導的氧耗激增（圖7），與ATP合成下降（圖6B）形成“代謝解偶聯(lián)”的直接證據(jù)。

 

證實WGA/PHA與FCCP作用機制相似，為 新型內(nèi)源性解偶聯(lián)劑。

 

時間分辨率優(yōu)勢：

 

電極實時追蹤顯示W(wǎng)GA效應(yīng)在 1分鐘內(nèi)啟動（圖7），早于傳統(tǒng)生化檢測（15分鐘），揭示快速代謝重編程。

 

(3) 研究意義

 

 

機制深度解析：

 

Unisense數(shù)據(jù)將 氧代謝動態(tài)變化 與 ATP合成效率（圖6）及 膜電位崩潰（圖8）關(guān)聯(lián)，確立“氧化應(yīng)激→代謝解偶聯(lián)→能量危機→細胞死亡”的完整鏈條。

 

技術(shù)不可替代性：

 

相比間接氧耗檢測法（如熒光探針），Unisense電極的 高靈敏度（μM級O?變化）和 無標記檢測 避免干擾細胞生理狀態(tài)，是代謝研究的金標準。

 

總結(jié)

 

本研究通過 Unisense電極的高精度氧代謝監(jiān)測，首次揭示凝集素通過 解偶聯(lián)氧化磷酸化 誘導血小板能量危機，其技術(shù)價值在于：

 

1.動態(tài)代謝圖譜：Unisense捕捉WGA/PHA的快速氧耗激增（圖7），為“解偶聯(lián)劑”假說提供實時證據(jù)。

2.機制關(guān)聯(lián)橋梁：氧代謝數(shù)據(jù)與ATP合成（圖6）、膜電位（圖8）及Nox活性（圖5）的多維度關(guān)聯(lián)，確立氧化應(yīng)激與能量衰竭的因果鏈。

3.轉(zhuǎn)化醫(yī)學啟示：凝集素的解偶聯(lián)效應(yīng)或與 心血管疾病中線粒體功能障礙 相關(guān)，Unisense技術(shù)為相關(guān)藥物篩選提供可靠平臺。

 

這一發(fā)現(xiàn)凸顯凝集素在血栓炎癥中的病理作用，并為Unisense電極在細胞代謝研究中的不可替代性提供范例。