Hydrogen treatment prevents lipopolysaccharide-induced pulmonary endothelial cell dysfunction through RhoA inhibition

氫處理可通過抑制RhoA抑制脂多糖誘導的肺內(nèi)皮細胞功能障礙

來源：Biochemical and Biophysical Research Communications 522 (2020) 499e505

 

1. 論文摘要核心內(nèi)容

 

本研究首次揭示 富氫培養(yǎng)基（H?） 通過抑制 RhoA/ROCK信號通路 保護肺微血管內(nèi)皮細胞（PMVECs）免受膿毒癥（LPS模擬）損傷：

 

屏障保護：H?逆轉(zhuǎn)LPS誘導的緊密連接蛋白（Occludin）和黏附連接蛋白（VE-cadherin）表達下降（圖1A-F），維持內(nèi)皮屏障完整性。

 

 

抗凋亡作用：H?降低LPS誘導的細胞凋亡（圖3F）和乳酸脫氫酶（LDH）釋放（圖3E），提升細胞活力（圖1G, 3D）。

 

 

機制靶點：H?抑制RhoA活性（圖3A-C）及下游ROCK表達（圖2A-B），阻斷細胞骨架重構和連接蛋白解體。

 

 

代謝干預：H?通過調(diào)控RhoA通路維持PMVEC能量穩(wěn)態(tài)，防止膿毒癥相關急性肺損傷（ALI）。

 

2. 研究目的

 

1.驗證 H?對LPS誘導的PMVEC屏障破壞（連接蛋白下調(diào)）的保護作用。

2.闡明 RhoA/ROCK通路 在膿毒癥內(nèi)皮損傷中的核心地位及H?的干預機制。

3.探索H?作為新型治療劑防治膿毒癥相關ALI的潛力。

 

3. 研究思路

 

1.細胞模型構建：

 

LPS（1 μg/mL）模擬膿毒癥刺激PMVECs，富氫培養(yǎng)基（0.6 mM H?）干預（方法2.2）。

 

抑制劑對照：ROCK抑制劑Y-27632、RhoA激活劑U-46619（圖2-3）。

2.屏障功能評估：

 

連接蛋白：Western blot檢測Occludin/VE-cadherin表達（圖1, 3G-I）。

 

細胞活性：MTT法測細胞活力（圖1G, 3D）、LDH釋放率（圖3E）、Annexin V-FITC凋亡檢測（圖3F）。

3.信號通路解析：

 

RhoA活性：GST pull-down法測GTP-RhoA（圖3A-C）。

 

ROCK表達：Western blot檢測（圖2A-B）。

4.機制驗證：

 

激活RhoA（U-46619）反向驗證H?的保護作用（圖3）。

 

4. 關鍵數(shù)據(jù)及研究意義

(1) H?對連接蛋白的保護作用（圖1）

 

數(shù)據(jù)：

 

LPS處理24小時，Occludin表達下降60%（圖1E），VE-cadherin下降45%（圖1C）。

 

H?干預使Occludin恢復至87%、VE-cadherin至92%（vs. 對照組）。

 

意義：首次證實H?通過維持連接蛋白表達保護內(nèi)皮屏障，為膿毒癥ALI提供治療靶點。

 

(2) H?抑制RhoA/ROCK通路（圖2-3）

 

數(shù)據(jù)：

 

LPS使RhoA活性升高2.5倍（圖3C），ROCK表達增加45%（圖2B）。

 

H?處理使RhoA活性降低58%（圖3C），ROCK表達恢復至基線（圖2B）。

 

意義：確立RhoA為膿毒癥內(nèi)皮損傷的核心調(diào)控因子，H?通過靶向抑制該通路發(fā)揮保護作用。

 

(3) H?的抗凋亡效應（圖3）

 

數(shù)據(jù)：

 

LPS使細胞凋亡率增加3.2倍（圖3F），LDH釋放升高80%（圖3E）。

 

H?干預使凋亡率降低67%（圖3F），LDH釋放減少62%（圖3E）。

 

意義：H?通過抑制RhoA依賴性凋亡途徑維持PMVEC存活，阻斷膿毒癥向多器官衰竭進展。

 

(4) 機制特異性驗證（圖3）

 

數(shù)據(jù)：RhoA激活劑U-46619加劇LPS的損傷效應（凋亡率↑120%），而H?完全逆轉(zhuǎn)此效應（圖3D-F）。

 

意義：RhoA是H?保護作用的直接靶點，為其臨床應用提供分子依據(jù)。

 

5. 結論

 

1.H?是膿毒癥ALI的潛在治療劑：通過抑制RhoA活性，維持連接蛋白（Occludin/VE-cadherin）表達和內(nèi)皮屏障功能。

2.RhoA/ROCK是核心靶通路：H?阻斷該通路可減少PMVEC凋亡，緩解肺微血管滲漏和水腫。

3.轉(zhuǎn)化價值：富氫培養(yǎng)基為膿毒癥相關肺損傷提供新型無創(chuàng)干預策略。

 

6. 丹麥Unisense電極的核心價值

(1) 技術突破性應用

 

實時動態(tài)監(jiān)測H?濃度：

 

采用 Unisense高靈敏度氫傳感器（方法2.2）直接測定富氫培養(yǎng)基的溶解H?濃度（0.60±0.03 mM），24小時后仍保持0.23±0.01 mM（圖未展示，見方法2.2）。

 

關鍵意義：首次實現(xiàn)細胞培養(yǎng)體系中H?濃度的精準定量與動態(tài)追蹤，確保實驗條件可控。

 

(2) 科學貢獻

 

確立H?給藥的可靠性：

 

Unisense數(shù)據(jù)證實富氫培養(yǎng)基的H?濃度穩(wěn)定維持于治療窗內(nèi)（>0.2 mM），為后續(xù)機制研究提供濃度依據(jù)。

 

排除H?濃度波動對結果的干擾，確保RhoA抑制效應（圖3）等結論的嚴謹性。

 

(3) 研究意義

 

技術不可替代性：

 

相比傳統(tǒng)氣相色譜法，Unisense電極的微創(chuàng)實時監(jiān)測（響應時間<1秒）避免樣本破壞，實現(xiàn)原位動態(tài)分析。

 

為氫氣生物醫(yī)學研究提供金標準檢測工具，推動H?治療從動物模型向臨床轉(zhuǎn)化。

 

總結

 

本研究通過 Unisense電極的精準氫濃度監(jiān)測，首次揭示H?通過抑制RhoA/ROCK通路保護膿毒癥內(nèi)皮屏障的機制，其技術價值在于：

 

1.參數(shù)標準化：Unisense確保H?濃度精確可控（0.6 mM），為機制研究奠定基礎。

2.動態(tài)藥效關聯(lián)：H?代謝動力學數(shù)據(jù)（24小時衰減曲線）與細胞保護效應（圖1-3）直接關聯(lián)，確立給藥窗口。

3.轉(zhuǎn)化醫(yī)學橋梁：Unisense技術為氫氣療法的劑量優(yōu)化和臨床給藥方案提供關鍵支持，推動膿毒癥治療創(chuàng)新。

 

這一發(fā)現(xiàn)凸顯Unisense電極在氣體治療研究中的不可替代性，為精準醫(yī)學提供技術范式。