Hydrogen improves cell viability partly through inhibition of autophagy and activation of PI3K/Akt/GSK3β signal pathway in a microvascular endothelial cell model of traumatic brain injury

在創(chuàng)傷性腦損傷的微血管內(nèi)皮細(xì)胞模型中，氫氣部分通過抑制自噬和激活 PI3K Akt GSK3β 信號(hào)通路來提高細(xì)胞活力

來源：NEUROLOGICAL RESEARCH 2020, VOL. 42, NO. 6, 487–496

 

1. 論文摘要核心內(nèi)容

 

研究通過建立腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（bEnd.3）劃痕損傷模型模擬TBI，探究氫氣（H?）的保護(hù)機(jī)制。核心發(fā)現(xiàn)：

 

氫氣顯著提升TBI后細(xì)胞活力（MTT檢測(cè)），并激活PI3K/Akt/GSK3β信號(hào)通路（Western blot驗(yàn)證）。

 

氫氣抑制自噬激活（降低LC3-II/I、Beclin-1表達(dá)），而自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（Rapamycin）可逆轉(zhuǎn)氫氣的保護(hù)作用。

 

PI3K抑制劑（LY294002）阻斷氫氣效應(yīng)，證實(shí)PI3K/Akt/GSK3β通路是氫氣抑制自噬的關(guān)鍵上游機(jī)制。

 

結(jié)論：氫氣通過激活PI3K/Akt/GSK3β通路抑制自噬，改善TBI后內(nèi)皮細(xì)胞存活，為氫氣治療TBI提供新機(jī)制依據(jù)。

 

2. 研究目的

 

闡明氫氣減輕TBI后血腦屏障（BBB）損傷的分子機(jī)制。

 

驗(yàn)證氫氣是否通過調(diào)控PI3K/Akt/GSK3β信號(hào)通路和自噬發(fā)揮保護(hù)作用。

 

探索氫氣治療TBI的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

 

3. 研究思路

 

1.模型建立：

 

采用小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（bEnd.3）建立劃痕損傷模型（模擬TBI機(jī)械損傷）。

 

分組：假手術(shù)組（Sham）、假手術(shù)+氫氣組（Sham+H?）、TBI組、TBI+氫氣組（TBI+H?）、TBI+氫氣+PI3K抑制劑組（TBI+H?+LY）、TBI+氫氣+自噬誘導(dǎo)劑組（TBI+H?+Rap）。

 

2.干預(yù)設(shè)計(jì)：

 

氫氣干預(yù)：使用富氫培養(yǎng)基（0.60 ± 0.03 mM，Unisense電極標(biāo)定）。

 

通路調(diào)控：PI3K抑制劑（LY294002）和自噬誘導(dǎo)劑（雷帕霉素）。

3.檢測(cè)指標(biāo)：

 

細(xì)胞形態(tài)與活力：劃痕愈合率（圖1）、MTT細(xì)胞活力（圖2a, 4a, 6a）。

 

 

 

 

信號(hào)通路蛋白：p-Akt、p-GSK3β（Western blot，圖2b-d, 4b-d, 6b-d）。

 

自噬標(biāo)志物：LC3-II/I、Beclin-1、p62（Western blot/免疫熒光，圖3, 5, 7）。

 

 

 

 

4. 關(guān)鍵數(shù)據(jù)及研究意義

(1) 氫氣促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)（圖1）

 

 

數(shù)據(jù)：劃痕后24小時(shí)，TBI+H?組細(xì)胞再內(nèi)皮化程度顯著高于TBI組（圖1d），而PI3K抑制劑（LY294002）或自噬誘導(dǎo)劑（Rap）削弱該效應(yīng)（圖1e-f）。

 

意義：氫氣通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)減輕BBB損傷，且依賴PI3K通路和自噬抑制。

 

(2) 氫氣提升細(xì)胞活力（圖2a, 4a, 6a）

 

數(shù)據(jù)：

 

TBI組細(xì)胞活力顯著下降（vs Sham組），氫氣干預(yù)后活力恢復(fù)（圖2a）。

 

LY294002或雷帕霉素處理取消氫氣保護(hù)作用（圖4a, 6a）。

 

意義：氫氣保護(hù)作用依賴PI3K/Akt/GSK3β通路激活和自噬抑制。

 

(3) 氫氣激活PI3K/Akt/GSK3β通路（圖2b-d, 4b-d）

 

數(shù)據(jù)：

 

TBI激活p-Akt/p-GSK3β，氫氣進(jìn)一步強(qiáng)化該效應(yīng)（圖2b-d）。

 

LY294002抑制通路蛋白表達(dá)（圖4b-d）。

 

意義：PI3K/Akt/GSK3β是氫氣保護(hù)作用的核心信號(hào)軸。

 

(4) 氫氣抑制自噬（圖3, 5, 7）

 

數(shù)據(jù)：

 

TBI誘導(dǎo)自噬（LC3-II/I、Beclin-1↑），氫氣顯著抑制其表達(dá)（圖3a-d）。

 

LY294002解除氫氣對(duì)自噬的抑制（圖5a-d），雷帕霉素激活自噬并降低細(xì)胞活力（圖7a-e）。

 

意義：氫氣通過PI3K/Akt/GSK3β通路抑制自噬，維持內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

 

5. 研究結(jié)論

 

1.氫氣通過激活PI3K/Akt/GSK3β通路抑制自噬，改善TBI后內(nèi)皮細(xì)胞活力與修復(fù)能力。

2.自噬在TBI中具有損傷作用，氫氣通過抑制自噬發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。

3.PI3K抑制劑（LY294002）和自噬誘導(dǎo)劑（雷帕霉素）可逆轉(zhuǎn)氫氣保護(hù)作用，證實(shí)機(jī)制特異性。

4.氫氣治療TBI具有潛在臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值，需進(jìn)一步探索體內(nèi)驗(yàn)證及劑量?jī)?yōu)化。

 

6. 丹麥Unisense電極的核心價(jià)值

(1) 技術(shù)角色

 

精確標(biāo)定氫氣濃度：

 

使用Unisense針型氫傳感器（Unisense A/S, Aarhus, Denmark）實(shí)時(shí)檢測(cè)富氫培養(yǎng)基濃度（0.60 ± 0.03 mM），確保實(shí)驗(yàn)條件一致性（方法部分）。

 

解決氣體治療關(guān)鍵難題：氫氣溶解度低、易擴(kuò)散，Unisense電極提供高精度、實(shí)時(shí)濃度監(jiān)測(cè)，排除劑量偏差對(duì)結(jié)果的干擾。

 

(2) 研究意義

 

1.機(jī)制可靠性保障：

 

精確的氫氣濃度控制確保PI3K/自噬機(jī)制結(jié)論的可重復(fù)性，避免濃度波動(dòng)導(dǎo)致的假陽(yáng)性/陰性。

2.方法學(xué)創(chuàng)新：

 

為氣體治療研究提供標(biāo)準(zhǔn)化方案，推動(dòng)氫氣在神經(jīng)保護(hù)領(lǐng)域的應(yīng)用。

3.臨床轉(zhuǎn)化橋梁：

 

Unisense電極的定量數(shù)據(jù)為未來臨床劑量設(shè)計(jì)提供參考（如吸入氫氣濃度、富氫液體輸注方案）。

 

(3) 領(lǐng)域貢獻(xiàn)

 

 

填補(bǔ)技術(shù)空白：解決體外氣體治療濃度監(jiān)測(cè)難題，提升實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)性。

 

推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療：為氫氣治療TBI的劑量-效應(yīng)關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。

 

核心圖示：氫氣保護(hù)機(jī)制通路

 

TBI損傷 → [PI3K/Akt/GSK3β通路抑制] + [自噬激活] → 細(xì)胞活力↓

↓

氫氣干預(yù) → 激活PI3K/Akt/GSK3β → 抑制自噬 → 細(xì)胞修復(fù)↑

 

總結(jié)：

 

本研究通過細(xì)胞模型闡明氫氣治療TBI的新機(jī)制，Unisense電極在氫氣濃度標(biāo)定中的關(guān)鍵作用保障了機(jī)制的可靠性，為靶向PI3K/自噬通路的神經(jīng)保護(hù)策略提供理論依據(jù)。未來需結(jié)合動(dòng)物模型驗(yàn)證，并探索Unisense技術(shù)在體內(nèi)氫氣監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用潛力。