Botrytis cinerea induces local hypoxia in Arabidopsis leaves

灰葡萄孢菌誘導擬南芥葉片局部缺氧

來源：New Phytologist (2021) 229: 173–185

 

1. 摘要核心內容

 

本研究首次揭示灰霉菌（Botrytis cinerea）感染擬南芥葉片時，通過增強植物呼吸作用導致局部耗氧，誘導缺氧微環境：

 

缺氧誘導機制：灰霉菌感染區呼吸速率升高3倍（圖2d），局部氧濃度從18%降至<2%（圖2b），激活植物缺氧響應通路。

 

分子樞紐作用：缺氧穩定ERF-VII轉錄因子（如RAP2.12），促進其核定位（圖3），增強植物抗病性；ERF-VII五重突變體（erfvii）病斑面積擴大。

 

 

特異性誘導：該現象僅見于壞死性真菌（灰霉菌、鏈格孢），而在半活體營養型細菌（Pseudomonas syringae）中未出現。

 

2. 研究目的

 

驗證病原體誘導缺氧假說：探究灰霉菌感染是否在葉片中創造局部缺氧環境。

 

解析ERF-VII蛋白穩定機制：明確缺氧是否穩定ERF-VII轉錄因子（如RAP2.12）。

 

闡明抗病性調控通路：揭示缺氧-ERF-VII通路在植物抵御灰霉菌中的作用。

 

3. 研究思路

 

病原體與處理設計：

 

對比灰霉菌（壞死性真菌）、鏈格孢（壞死性真菌）和丁香假單胞菌（半活體細菌）。

 

添加植物防御誘導子（flg22、OGs）和激素（ABA、乙烯抑制劑1-MCP）作為對照。

 

多維度檢測：

 

缺氧標志物：qPCR檢測缺氧響應基因（ADH1, HRE2）；pPCO1:GUS報告系統定位缺氧區域（圖2a）。

 

氧氣動力學：Unisense OXR50微電極（丹麥PyroScience）原位測量葉片氧濃度（圖2b）。

 

蛋白定位：激光共聚焦顯微鏡觀察RAP2.12-GFP亞細胞分布（圖3）。

 

生理指標：呼吸速率測定（圖2d）；乙烯產量檢測（圖4a）。

 

遺傳材料驗證：

 

ERF-VII功能缺失突變體（erfvii）與過表達株系（35S:Δ-RAP2.12）。

 

灰霉菌敏感突變體（pad3）。

 

4. 關鍵數據及研究意義

(1) 局部缺氧證據（圖2）

 

數據來源：Unisense微電極（OXR50）原位穿刺測量。

 

發現：

 

灰霉菌感染區氧濃度從18%驟降至<2%（圖2b），而呼吸速率升高3倍（圖2d）。

 

pad3突變體缺氧發生更快，與病斑擴展速度正相關（圖2e）。

 

意義：首次證明壞死性真菌通過增強寄主呼吸耗氧誘導局部缺氧。

 

(2) ERF-VII蛋白穩定化（圖3）

 

數據來源：RAP2.12-GFP熒光定位（Zeiss Airyscan共聚焦顯微鏡）。

 

發現：

 

感染區RAP2.12-GFP核內熒光強度增加2.5倍（圖3b），表明缺氧穩定ERF-VII并促進核定位。

 

erfvii突變體病斑面積擴大40%，證實ERF-VII的抗病功能。

 

意義：建立"病原體感染→缺氧→ERF-VII穩定→抗病基因激活"的直接關聯。

 

(3) 信號通路特異性（圖4-7）

 

數據來源：qPCR（基因表達）、GUS染色（缺氧報告）、乙烯測定（GC）。

 

發現：

 

乙烯雖誘導產生（圖4a），但抑制劑1-MCP不影響缺氧響應基因（圖4c），表明缺氧獨立于乙烯通路。

 

ABA可誘導ADH1但灰霉菌感染中ABA水平未升高（圖6b），排除ABA主導缺氧響應。

 

防御誘導子（flg22/OGs）不誘發缺氧（圖7）。

 

意義：灰霉菌特異性通過代謝耗氧（非激素或防御信號）誘導缺氧。

 

5. 核心結論

 

局部缺氧機制：灰霉菌通過增強寄主呼吸耗氧，在感染區創造缺氧微環境（氧濃度<2%）。

 

ERF-VII樞紐作用：缺氧穩定ERF-VII轉錄因子（如RAP2.12），促進其核定位并激活抗病基因。

 

通路特異性：該過程獨立于乙烯、ABA及防御誘導子信號，由病原體直接代謝干擾驅動。

 

生態意義：缺氧可能利于真菌代謝寡聚半乳糖醛酸（OGs），但同步激活植物抗病防線（圖8）。

 

6. 丹麥Unisense電極數據的詳細解讀

技術原理與方法

 

設備型號：FireStingO?光纖氧測量系統（PyroScience）配合OXR50針式微電極（尖端直徑50μm）。

 

實驗設計：

 

微電極通過Unisense MM33微操縱器精準插入葉片感染區（圖2b）。

 

實時記錄氧分壓（kPa）與溫度（TDIP15探頭校正）。

 

空間分辨率：單點穿刺測量，定位精度±10μm。

 

關鍵發現與意義

 

缺氧的直接證據：

 

定量數據：感染區氧濃度從18.0±0.5%降至1.8±0.3%（圖2b），提供病原體誘導缺氧的首個原位證據。

 

時間動態：pad3突變體在24hpi即達缺氧閾值（<5%），而野生型需48h（圖2e），揭示缺氧速度與感病性正相關。

 

意義：推翻"葉片完全通氣"的固有認知，確立局部缺氧為新型病原體-寄主互作特征。

 

技術優勢解析：

 

原位無損：微電極穿刺避免組織破壞，真實反映活體微環境氧動態。

 

高靈敏度：檢測限0.05% O?，精準捕捉近無氧狀態（圖2b）。

 

時空特異性：鎖定感染中心區（直徑<2mm），排除周邊組織干擾。

 

生理關聯：結合呼吸速率數據（圖2d），證實耗氧增加是缺氧主因。

 

生物學啟示：

 

代謝戰視角：灰霉菌通過"呼吸競賽"消耗局部氧氣，創造利于自身生長的缺氧微環境。

 

雙刃劍效應：缺氧雖可能促進真菌代謝OGs，但同步激活植物ERF-VII防御通路（圖8）。

 

育種新靶點：ERF-VII穩定化策略（如修飾N-degron通路）或可增強作物抗病性。

 

總結

 

本研究通過整合Unisense微電極技術與分子遺傳學手段，揭示灰霉菌感染通過"呼吸競賽"在植物葉片創造局部缺氧微環境，穩定ERF-VII轉錄因子并激活抗病通路。丹麥Unisense電極提供的高分辨率原位氧數據是該研究的基石：

 

技術貢獻：50μm針式電極實現活體組織精準穿刺，直接量化病原體誘導的氧動態變化。

 

理論突破：確立"局部缺氧"為植物-病原體互作新維度，拓展了缺氧生物學的研究范疇。

 

應用前景：ERF-VII通路可作為抗病育種靶點，微電極技術為抗逆表型篩選提供可靠工具。