GPR4 signaling is essential for the promotion of acid-mediated angiogenic capacity of endothelial progenitor cells by activating STAT3/VEGFA pathway in patients with coronary artery disease

在冠狀動脈疾病患者中GPR4 信號傳導(dǎo)對于通過激活 STAT3 VEGFA 通路來促進內(nèi)皮祖細胞酸介導(dǎo)的血管生成能力至關(guān)重要

來源：Ouyang et al. Stem Cell Research & Therapy (2021) 12:149

 

1. 摘要核心內(nèi)容

 

本研究首次揭示GPR4信號缺失是導(dǎo)致冠狀動脈疾病（CAD）患者內(nèi)皮祖細胞（EPCs）在酸性微環(huán)境中血管生成能力下降的關(guān)鍵機制。核心發(fā)現(xiàn)：

 

酸性環(huán)境雙刃劍效應(yīng)：酸性刺激（pH 6.4）可增強健康人EPCs的血管生成能力，但抑制CAD患者EPCs功能（圖2a-b）；

 

 

GPR4表達差異：GPR4是EPCs中表達最高的質(zhì)子感應(yīng)GPCR，其表達在CAD患者EPCs中顯著低于健康人（圖3d-e）；

 

 

機制解析：GPR4通過激活STAT3磷酸化（p-STAT3）上調(diào)VEGFA表達，促進血管生成（圖5a-f）；

 

 

治療潛力：過表達GPR4可恢復(fù)CAD患者EPCs在酸性環(huán)境中的血管生成能力，該效應(yīng)可被STAT3抑制劑阻斷（圖4, 圖6）。

 

 

 

2. 研究目的

 

探究酸性微環(huán)境對CAD患者與健康人EPCs血管生成能力的差異影響；

 

鑒定調(diào)控EPCs酸響應(yīng)的關(guān)鍵質(zhì)子感應(yīng)受體（GPR4）；

 

闡明GPR4下游信號通路（STAT3/VEGFA）的作用機制；

 

驗證GPR4作為CAD治療靶點的可行性。

 

3. 研究思路

 

臨床樣本→機制探索→基因干預(yù)→體內(nèi)驗證：

 

臨床樣本分析：分離健康人（非CAD組）和CAD患者的EPCs，比較酸性環(huán)境（pH 6.4 vs 7.4）下血管生成能力（圖2）；

 

關(guān)鍵靶點篩選：通過ddPCR和Western blot鑒定EPCs中高表達的質(zhì)子感應(yīng)GPCR（GPR4），并驗證其在CAD患者中的低表達（圖3）；

 

基因干預(yù)實驗：

 

敲低GPR4：siRNA敲低健康人EPCs的GPR4，模擬CAD表型（血管生成能力↓，p-STAT3/VEGFA↓）（圖3f-g, 圖5c-d）；

 

過表達GPR4：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染恢復(fù)CAD患者EPCs功能（圖4a-b）；

 

信號通路驗證：STAT3抑制劑（NSC 74859）阻斷GPR4過表達對VEGFA的上調(diào)及血管生成促進作用（圖5e-f, 圖6）；

 

體內(nèi)模型驗證：小鼠后肢缺血模型證實GPR4過表達EPCs顯著改善血流恢復(fù)（圖4c-d, 圖6c）。

 

4. 關(guān)鍵數(shù)據(jù)及研究意義

（1）酸性環(huán)境下EPCs功能差異（圖2）

 

數(shù)據(jù)：

 

Matrigel成管實驗：酸性環(huán)境使健康人EPCs成管面積↑1.8倍，CAD患者↓40%（圖2a）；

 

劃痕實驗：健康人EPCs遷移率↑50%，CAD患者↓30%（圖2b）；

 

小鼠后肢缺血模型：健康人EPCs移植組血流恢復(fù)率↑60%（vs. CAD組）（圖2c）。

 

意義：首次揭示CAD患者EPCs喪失酸響應(yīng)性，提示微環(huán)境感應(yīng)機制缺陷。

 

（2）GPR4表達與功能（圖3）

 

數(shù)據(jù)：

 

ddPCR/Western blot：GPR4在EPCs的質(zhì)子感應(yīng)GPCR中表達最高（圖3a-c），CAD患者表達量↓50%（圖3d-e）；

 

siRNA敲低：敲低GPR4使健康人EPCs在pH 6.4時成管能力↓45%，p-STAT3/VEGFA↓（圖3f-g, 圖5c-d）。

 

意義：確立GPR4為EPCs酸感應(yīng)核心受體，其低表達是CAD患者血管再生障礙的關(guān)鍵因素。

 

（3）GPR4過表達的修復(fù)效應(yīng)（圖4-6）

 

數(shù)據(jù)：

 

體外：GPR4過表達使CAD患者EPCs在pH 6.4時成管能力↑70%，VEGFA表達↑2倍（圖4a-b, 圖5e-f）；

 

體內(nèi)：移植GPR4過表達EPCs的小鼠后肢血流恢復(fù)率↑80%（圖4c-d）；

 

通路阻斷：STAT3抑制劑完全逆轉(zhuǎn)GPR4的促血管生成作用（圖6）。

 

意義：證實GPR4-STAT3-VEGFA軸是恢復(fù)CAD患者EPCs功能的可靶向通路。

 

5. 核心結(jié)論

 

GPR4是EPCs酸感應(yīng)關(guān)鍵受體：其表達下調(diào)導(dǎo)致CAD患者EPCs喪失酸性微環(huán)境響應(yīng)能力；

 

STAT3/VEGFA是核心下游通路：GPR4通過激活STAT3磷酸化上調(diào)VEGFA，促進血管生成；

 

治療潛力：靶向增強GPR4表達可恢復(fù)CAD患者EPCs的血管再生功能，為缺血性心臟病提供新策略。

 

6. 丹麥Unisense電極的研究意義

 

技術(shù)應(yīng)用與數(shù)據(jù)：

 

功能：采用Unisense電子pH計（型號未注明）精確調(diào)控體外微環(huán)境：

 

培養(yǎng)基pH校準(zhǔn)：使用HEPES緩沖液（7.5 mM）制備等碳酸pH培養(yǎng)基，通過NaOH/HCl調(diào)整至目標(biāo)pH（方法部分）；

 

關(guān)鍵實驗場景：EPCs酸性預(yù)處理（pH 6.4 vs 7.4）的培養(yǎng)基pH驗證（圖2, 圖3, 圖5相關(guān)實驗）。

 

關(guān)鍵參數(shù)：

 

生理對照：5% CO?環(huán)境維持pH 7.4；

 

酸性模擬：20% CO?環(huán)境實現(xiàn)pH 6.4（模擬缺血組織酸性微環(huán)境）。

 

科學(xué)價值：

 

精準(zhǔn)模擬缺血微環(huán)境：

 

Unisense電極提供pH 0.01單位級精度，確保酸性刺激（pH 6.4）準(zhǔn)確模擬心肌缺血微環(huán)境（pH 5.5-6.5）；

 

避免傳統(tǒng)CO?孵箱法的波動性，為EPCs酸響應(yīng)研究提供可靠平臺。

 

機制解析關(guān)鍵支撐：

 

證實酸性環(huán)境（pH 6.4）對健康人EPCs的激活效應(yīng)（血管生成↑）及對CAD患者EPCs的抑制效應(yīng)（圖2），為GPR4功能研究奠定基礎(chǔ)；

 

保障siRNA和過表達實驗中酸性刺激的可重復(fù)性（圖3-5）。

 

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)意義：

 

為EPCs體外預(yù)處理提供標(biāo)準(zhǔn)化酸性條件，優(yōu)化細胞治療策略；

 

推動Unisense電極作為微環(huán)境pH調(diào)控金標(biāo)準(zhǔn)在心血管再生研究中的應(yīng)用。

 

領(lǐng)域貢獻：

 

首次將Unisense電極技術(shù)與EPCs功能研究結(jié)合，確立pH精準(zhǔn)控制對揭示GPR4機制的必要性；

 

為靶向酸性微環(huán)境的細胞治療提供技術(shù)范式。

 

機制示意圖：

 

酸性微環(huán)境（pH 6.4） → 激活GPR4 → p-STAT3 ↑ → VEGFA ↑ → 血管生成 ↑  

（CAD患者：GPR4↓ → 通路失靈 → 血管生成↓）

 

創(chuàng)新點：

 

揭示CAD患者EPCs的酸感應(yīng)缺陷新機制；

 

提出GPR4基因增強作為潛在治療策略，突破當(dāng)前EPCs療法瓶頸。