Enrichment and physiological characterization of a novel comammox Nitrospira indicates ammonium inhibition of complete nitrification

新型 comammox Nitrospira 的富集和生理特性表明銨抑制完全硝化作用

來源：The ISME Journal (2021) 15:1010–1024

 

一、摘要概述

 

本研究通過 連續(xù)膜生物反應(yīng)器富集 獲得一種新型完全氨氧化（comammox）硝化螺菌（Nitrospira），暫命名為 “Candidatus Nitrospira kreftii”。研究通過基因組和生理表征發(fā)現(xiàn)：

 

超高底物親和力：氨親和力（Km(app) NH3≈0.040±0.01 μM）高于已知comammox菌，亞硝酸鹽親和力（Km(app) NO2?=12.5±4.0 μM）表明其適應(yīng)貧營養(yǎng)環(huán)境。

銨抑制現(xiàn)象：低至 25 μM 銨濃度 即部分抑制氨氧化活性（圖4, 圖6），首次揭示comammox菌的銨敏感性。

 

 

生態(tài)位分化：銨耐受性差異可能是comammox菌種間競爭的關(guān)鍵因素。

 

二、研究目的

 

富集新型comammox菌：填補(bǔ)comammox菌純培養(yǎng)稀缺的空白（此前僅 N. inopinata 一株）。

解析生理特性：探究底物親和力、抑制閾值等參數(shù)，揭示生態(tài)適應(yīng)性。

驗(yàn)證銨抑制機(jī)制：闡明銨濃度對(duì)完全氨氧化的調(diào)控作用。

 

三、研究思路

 

采用 “富集培養(yǎng)→基因組分析→生理表征” 的三步策略：

 

富集培養(yǎng)：

利用 連續(xù)膜生物反應(yīng)器（5L容積）在低氨（≤2.5 mM）、50%氧飽和條件下培養(yǎng)39個(gè)月。

接種源含兩種comammox菌（原占比15%），最終富集至 90% Nitrospira（圖1）。

 

基因組解析：

宏基因組+納米孔測序 獲得完整基因組（4.13 Mb，GC含量54.5%）。

系統(tǒng)發(fā)育分析確認(rèn)其為 comammox clade A新種（圖2），命名“Ca. N. kreftii”。

 

代謝重構(gòu)顯示完整氨氧化通路（AMO/HAO/NXR）及尿素利用潛力（圖3）。

 

生理表征：

微呼吸測量技術(shù)（Unisense電極）定量氨/亞硝酸鹽氧化動(dòng)力學(xué)。

分析銨抑制效應(yīng)及菌膠團(tuán)尺寸對(duì)底物親和力的影響（圖4-7）。

 

 

四、關(guān)鍵數(shù)據(jù)及研究意義

1. 微生物群落動(dòng)態(tài)（圖1）

 

數(shù)據(jù)來源：FISH定量顯示富集過程中 Nitrospira 占比從15%升至90%（表S2）。

意義：證實(shí)低氨連續(xù)培養(yǎng)可高效富集comammox菌，為后續(xù)生理研究提供高純度生物量。

 

2. 基因組特征（圖2, 圖3）

 

數(shù)據(jù)來源：

系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）顯示“Ca. N. kreftii”屬于comammox clade A，與“Ca. N. nitrificans”親緣最近（77% ANI）。

代謝通路圖（圖3）證實(shí)完整氨氧化酶系（AMO/HAO/NXR）及氫酶（HYD）等輔助功能。

意義：提供第二個(gè)comammox菌完整基因組，揭示保守的氨氧化機(jī)制及獨(dú)特的鈉泵適應(yīng)機(jī)制。

 

3. 氨氧化動(dòng)力學(xué)與銨抑制（圖4, 圖6）

 

數(shù)據(jù)來源：Unisense電極測定耗氧率，擬合Haldane抑制模型：

超高氨親和力：Km(app) NH3=0.040±0.01 μM（圖4）。

銨抑制閾值：>25 μM銨顯著降低氧化速率，抑制常數(shù) Ki(app)=245.7±98.7 μM（圖6）。

意義：首次發(fā)現(xiàn)comammox菌的銨抑制現(xiàn)象，挑戰(zhàn)“comammox僅適應(yīng)貧營養(yǎng)”的認(rèn)知。

 

4. 亞硝酸鹽氧化動(dòng)力學(xué)（圖5, 圖7）

 

數(shù)據(jù)來源：Michaelis-Menten模型擬合：

高亞硝酸鹽親和力：Km(app) NO2?=12.5±4.0 μM（圖5）。

無抑制現(xiàn)象（圖7）。

意義：comammox菌亞硝酸鹽親和力顯著高于 N. inopinata（449 μM），表明種間分化。

 

5. 菌膠團(tuán)尺寸效應(yīng)（圖4-7）

 

數(shù)據(jù)來源：菌膠面積（5.5±10.4 μm2）與 Km(app) 正相關(guān)（r=0.84,p=0.038）。

意義：擴(kuò)散限制導(dǎo)致表觀親和力低估，需在生理模型中校正生物聚集體效應(yīng)。

 

五、結(jié)論

 

新型comammox資源：“Ca. N. kreftii”是第二個(gè)高純度富集的comammox菌，拓展了硝化微生物資源庫。

雙高親和力：其氨（0.04 μM）和亞硝酸鹽（12.5 μM）親和力均優(yōu)于多數(shù)AOB/AOA（圖8），適應(yīng)極端貧營養(yǎng)環(huán)境。

 

銨抑制的生態(tài)意義：銨抑制閾值（25 μM）低于所有已知硝化菌，表明 銨耐受性差異 是comammox菌種間生態(tài)位分化的關(guān)鍵因素。

技術(shù)啟示：連續(xù)膜生物反應(yīng)器是富集慢速生長硝化菌的有效策略。

 

六、丹麥Unisense電極數(shù)據(jù)的詳細(xì)解讀

1. 技術(shù)原理與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

 

原理：Unisense氧電極（RC-350呼吸室 + PA2000皮安計(jì)）基于 克拉克電極原理，通過鉑陰極還原溶解氧產(chǎn)生電流信號(hào)，靈敏度達(dá) nM級(jí)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

生物量洗滌后懸浮于HEPES緩沖液，注入NH?Cl/NaNO?啟動(dòng)反應(yīng)。

實(shí)時(shí)監(jiān)測 耗氧率，通過化學(xué)計(jì)量比（NH??:O? = 1:1.96）反推底物氧化速率（圖4-7）。

 

2. 關(guān)鍵結(jié)果與意義

 

氨氧化動(dòng)力學(xué)：

非線性擬合揭示 銨抑制現(xiàn)象（圖6a, c, e），推翻傳統(tǒng)Michaelis-Menten模型。

抑制常數(shù)（Ki）定量為 191.9±68.5 μM NH??，為環(huán)境氮循環(huán)模型提供關(guān)鍵參數(shù)。

亞硝酸鹽氧化：

線性動(dòng)力學(xué)（圖5, 圖7），證實(shí)comammox菌獨(dú)立完成全程硝化。

生物學(xué)意義：

首次證實(shí)comammox菌的銨敏感性，修正“comammox僅受貧營養(yǎng)選擇”的理論。

超高靈敏度檢測 瞬態(tài)代謝響應(yīng)，揭示底物波動(dòng)下（如污水處理廠）comammox活性調(diào)控機(jī)制。

技術(shù)創(chuàng)新價(jià)值：

微升級(jí)反應(yīng)體系（2 mL）減少樣品量需求，適用于難培養(yǎng)微生物的生理表征。

實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測 彌補(bǔ)靜態(tài)基因組分析的不足，為合成微生物群落構(gòu)建提供依據(jù)。

 

七、研究突破與局限

 

理論創(chuàng)新：

提出 “銨耐受性分化”假說，解釋comammox菌在氮循環(huán)中的生態(tài)位分配。

修正comammox底物親和力范圍（圖8），豐富貧營養(yǎng)微生物生理數(shù)據(jù)庫。

技術(shù)突破：

納米孔測序獲得 首個(gè)“Ca. N. kreftii”完整基因組。

Unisense電極實(shí)現(xiàn) 高時(shí)空分辨率生理監(jiān)測。

局限：

未獲得純培養(yǎng)，抑制機(jī)制未在分子水平驗(yàn)證。

菌膠團(tuán)效應(yīng)可能低估真實(shí)底物親和力。

 

圖表示例說明：

 

圖1（群落動(dòng)態(tài)）展示富集過程中 Nitrospira 占比變化。

圖2（系統(tǒng)發(fā)育）定位新菌分類地位。

圖3（代謝通路）注釋關(guān)鍵酶功能。

圖4-7（動(dòng)力學(xué)曲線）量化底物親和力與抑制效應(yīng)。

圖8（親和力對(duì)比）突顯新菌生理獨(dú)特性。