High-resolution structure and dynamics of mitochondrial complex I-Insights into the proton pumping mechanism

線粒體復合物 I 的高分辨率結構和動力學——深入了解質子泵送機制

來源：Parey et al., Sci. Adv. 7, eabj3221 (2021) 12 November 2021

 

一、摘要概述

 

本研究通過 2.1 ?高分辨率冷凍電鏡結構 解析了酵母 Yarrowia lipolytica 線粒體復合物I（NADH:泛醌氧化還原酶）的原子模型，揭示了以下關鍵發現：

 

水分子網絡：定位了超過 1600個蛋白結合水分子，其中約100個位于質子傳遞通路中（圖2）。

 

構象變化：在穩態活性條件下（3.4 ?分辨率）捕獲到 ND1亞基的構象重排（圖4），與質子注入親水軸相關。

質子泵機制：結合分子動力學模擬（MD）和點突變實驗，提出 醌（Q）還原驅動的質子傳遞模型（圖6），其中ND1亞基的構象變化調控質子傳遞至中央親水軸。

 

二、研究目的

 

解析質子傳遞路徑：明確復合物I中質子跨膜傳遞的原子級路徑，解決長期爭議的質子泵機制。

揭示構象動態耦合：闡明醌還原與質子傳遞的能量耦合機制。

驗證功能性不對稱：探究三個類轉運體亞基（ND2、ND4、ND5）在質子傳遞中的差異作用。

 

三、研究思路

 

采用 “高分辨結構解析→動態模擬→功能驗證” 的多層次策略：

 

結構解析：

通過冷凍電鏡獲得 2.1 ?分辨率的復合物I靜息態（D型）結構（圖1），定位水分子和脂質結合位點。

 

在穩態醌還原條件下捕獲 3.4 ?分辨率的活性態結構（圖4），對比構象變化。

 

動態模擬：

基于高分辨結構進行 大規模分子動力學模擬（圖3），分析質子化狀態對水合作用的影響。

驗證 Phe343的閘門功能（圖3B-D），該殘基阻斷ND4亞基的質子短路。

 

功能驗證：

點突變實驗（圖5A）：靶向ND1亞基關鍵殘基（如Glu107、Arg274），驗證其對復合物I活性的影響。

 

 

最小呼吸鏈重建：使用Unisense氧電極測量耗氧率，驗證質子泵與電子傳遞的耦合效率。

 

四、關鍵數據及研究意義

1. 質子傳遞路徑的水分子網絡（圖2）

 

數據來源：冷凍電鏡結構（2.1 ?）顯示膜臂亞基（ND2、ND4、ND5）中的 99個水分子（紅色球體）。

結果：

ND2亞基存在 44 ?連續水鏈，連接N側（基質）與中央親水軸。

ND4和ND5亞基的水合作用較弱，且被保守Phe343阻斷（圖3B）。

意義：首次在原子水平描繪質子傳遞路徑，證實水分子介導的長程質子傳遞。

 

2. ND1亞基構象變化（圖4-5）

 

數據來源：穩態活性結構（3.4 ?）顯示 ND1的TMH5-TMH6環重排。

結果：

活性態中 Glu210ND1取代Glu208ND1，形成新的鹽橋網絡（Arg274FS2/Arg302ND1）。

點突變 E107A/R274A使酶活性喪失＞90%（圖5A）。

意義：ND1構象變化是醌還原觸發質子傳遞的關鍵開關。

 

3. 質子泵模型（圖6）

 

數據來源：整合結構、模擬與生化數據。

結果：

醌還原釋放能量 → 質子加載位點（PLS）充電 → 質子注入E通道 → 驅動膜臂質子傳遞。

ND5亞基為唯一P側（膜間隙）質子出口（圖3C）。

意義：提出“質子注入驅動”機制（圖S16），解釋4H?/2e?的化學計量比。

 

五、結論

 

質子傳遞路徑：

鑒定出 連續水分子鏈 作為質子傳遞介質，其中ND2亞基水合程度最高。

ND5亞基是唯一P側質子出口，由其獨特脂質-蛋白界面決定（圖3C）。

能量耦合機制：

醌還原驅動ND1構象變化，觸發質子從N側注入中央親水軸。

保守 Phe343充當閘門，防止質子短路（圖3D）。

功能性不對稱：三個類轉運體亞基（ND2/ND4/ND5）具有 差異化的質子傳遞能力，避免能量耗散。

 

六、丹麥Unisense電極數據的詳細解讀

1. 技術原理與實驗設計

 

原理：Unisense氧電極基于 克拉克電極原理，通過鉑陰極還原溶解氧產生電流信號（靈敏度達nM級）。

實驗設計（材料與方法部分）：

構建 最小呼吸鏈系統：復合物I + 細胞色素 bo? 氧化酶 + 脫氫泛醌（DBQ）。

實時監測 耗氧率 反映質子泵與電子傳遞的耦合效率（圖6模型驗證）。

 

2. 關鍵結果與意義

 

數據定位：未在結果圖中展示，但為圖6模型提供關鍵驗證。

結果：

添加NADH后 耗氧率顯著升高，證實電子傳遞鏈完整。

抑制劑DQA或KCN 完全阻斷耗氧，驗證信號特異性。

生物學意義：

直接證明質子泵與電子傳遞的偶聯效率，支持“每2e?傳遞泵出4H?”的化學計量模型。

為 動態質子泵模型（圖6）提供功能學證據，彌補靜態結構的局限性。

技術創新價值：

高時空分辨率捕捉 瞬態耗氧動態，適用于膜蛋白復合物的功能表征。

微升級反應體系（2 mL）降低樣品量需求，推動微量生化分析。

 

七、研究突破與局限

 

理論創新：

提出 “質子注入驅動”機制（類比細胞色素c氧化酶），統一能量轉換模型。

揭示 ND1構象變化的核心作用，破解醌還原與質子傳遞的偶聯謎題。

技術突破：

迄今 最高分辨率（2.1 ?）的復合物I結構，定位脂質、水分子及輔因子。

冷凍電鏡+分子動力學模擬 揭示動態質子傳遞路徑。

局限：

ND4/ND5亞基的質子傳遞路徑仍不明確（需更高時間分辨率技術）。

未解析A型（活性態）向D型（失活態）轉換的構象動態。

 

圖表示例嵌入說明：

 

圖1（復合物I整體結構）嵌入“結構解析”部分

圖2（水分子分布）嵌入“質子傳遞路徑”章節

圖3（MD模擬水合作用）嵌入“閘門功能”章節

圖4（醌結合位點）嵌入“構象變化”章節

圖5（點突變效應）嵌入“功能驗證”章節

圖6（質子泵模型）嵌入“機制模型”核心結論