Nitric-oxide-driven oxygen release in anoxic Pseudomonas aeruginosa

缺氧銅綠假單胞菌中一氧化氮驅動的氧釋放

來源：iScience 24,103404，December 17, 2021

 

一、摘要概述

 

本研究通過微呼吸測量技術發現銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在缺氧起始階段會釋放氧氣（O?），并證明該過程由一氧化氮（NO）驅動：

 

O?釋放現象：在密閉培養體系中，野生型（WT）和△norB突變株（缺失一氧化氮還原酶）在缺氧起始階段均出現O?峰值（圖3）。

 

NO的核心作用：

NO??補充或NO供體（DPTA NONOate）可顯著放大O?峰值（圖4、圖6）。

 

 

 

△nirS-N突變株（無法產生NO）在NO??刺激下無O?釋放，但直接添加NO供體可恢復該現象（圖6）。

生理意義：NO介導的O?釋放可能幫助細菌適應缺氧環境，支持其從有氧到無氧代謝的過渡。

 

二、研究目的

 

探究NO歧化酶活性：驗證銅綠假單胞菌是否具有類似Methylomirabilis oxyfera的NO歧化酶（Nod），能將NO轉化為O?和N?。

解析O?釋放機制：闡明NO在缺氧起始階段觸發O?釋放的分子途徑。

評估生理適應性：揭示該現象對細菌在動態缺氧環境中生存的意義。

 

三、研究思路

 

采用 “表型觀察→突變體驗證→NO調控驗證” 策略：

 

表型發現：

密閉培養體系中，WT和△norB突變株在初始O?耗盡后出現O?峰值（圖3）。

△norB突變株因NO積累，O?峰值顯著高于WT（圖4）。

NO作用驗證：

添加NO??（NO前體）或NO供體均放大O?峰值（圖4、圖6）。

△nirS-N突變株（無法產NO）僅在直接添加NO供體時釋放O?（圖6）。

排除干擾因素：

無氧啟動的培養中無O?峰值（圖4），證明需初始O?觸發。

電極同步測量顯示NO上升先于O?釋放（圖7），證實時序關系。

 

 

四、關鍵數據及研究意義

1. O?釋放的NO依賴性（圖4、圖6）

 

數據來源：微呼吸測定O?濃度（圖4）、突變體表型（圖6）。

結果：

△norB突變株的O?峰值比WT高4倍（23.1 μM vs. 5.8 μM）。

NO供體（DPTA NONOate）使△nirS-N突變株恢復O?釋放能力。

意義：NO是O?釋放的直接觸發因子，且與Nor酶活性負相關。

 

2. 初始O?的必要性（圖4）

 

數據來源：有氧/無氧啟動培養對比。

結果：僅在有氧啟動的培養中檢測到O?峰值。

意義：O?釋放依賴于從有氧到無氧的代謝轉換過程。

 

3. NO與O?釋放的時序關系（圖7）

 

數據來源：Unisense微電極同步測量O?和NO濃度。

結果：NO濃度上升后立即出現O?峰值（時間差<5分鐘）。

意義：直接證明NO積累是O?釋放的前置事件。

 

4. 無Nod同源基因的證據

 

數據來源：基因組BLAST分析。

結果：未發現類似M. oxyfera的Nod同源基因。

意義：O?釋放可能通過未知酶促途徑或非經典機制實現。

 

五、結論

 

NO驅動O?釋放：銅綠假單胞菌在缺氧起始階段通過NO積累觸發O?釋放，△norB突變株因NO累積放大該效應。

生理適應性：釋放的O?可能幫助細菌：

激活有氧代謝相關基因（如高親和力末端氧化酶）。

緩解缺氧壓力，支持從有氧到無氧呼吸的過渡。

生態意義：該機制或減少溫室氣體N?O排放（因繞過反硝化途徑）。

 

六、丹麥Unisense電極數據的詳細解讀

1. 技術原理與實驗設計

 

原理：Unisense微電極采用安培法，通過氧依賴性電化學還原反應實時檢測溶解氧（分辨率達μM級）。

實驗設計：

使用雙腔室玻璃反應器（圖7B），內置O?和NO微電極。

同步監測△norB突變株在添加NO??后的O?/NO動態變化（37°C，持續攪拌）。

 

2. 關鍵結果（圖7）

 

數據定位：圖7A（O?/NO濃度時序圖）。

結果：

NO先于O?上升：NO濃度在O?耗盡后迅速升高，峰值達15 μM。

O?釋放緊隨其后：NO達峰后5分鐘內，O?濃度從0升至8 μM。

無外部O?干擾：密閉系統排除大氣O?擴散可能。

意義：

首次在細菌中捕獲NO→O?的實時轉化動態，為NO驅動O?釋放提供直接證據。

揭示該過程的瞬態特征（峰值維持約10分鐘），解釋傳統方法難以檢測的原因。

 

3. 研究價值

 

技術創新：

實現雙參數（O?/NO）原位同步監測，突破單參數測量的局限性。

微米級空間分辨率避免樣品破壞，捕捉到傳統宏量分析遺漏的瞬態事件。

生物學啟示：

證實銅綠假單胞菌存在跨界代謝靈活性（有氧/無氧代謝耦合）。

為理解細菌在宿主缺氧環境（如囊性纖維化肺部）的適應性提供新視角。

 

七、研究意義與局限

 

理論創新：

發現首個病原菌中NO驅動的O?釋放現象，拓展對細菌代謝可塑性的認知。

提出“NO介導的微氧爆發”模型，解釋細菌在動態缺氧環境中的生存策略。

應用潛力：

為抗生物膜策略提供新靶點（如干擾NO信號通路）。

啟示優化污水處理中反硝化工藝以減少N?O排放。

局限：

未明確O?釋放的酶學機制（需同位素標記實驗驗證）。

未解析相關基因調控網絡（需轉錄組學進一步研究）。

 

圖表示例嵌入說明：

 

圖3（O?動態曲線）嵌入“表型發現”部分

圖4（突變體O?峰值）嵌入“NO依賴性”章節

圖6（NO供體效應）嵌入“機制驗證”章節

圖7（O?/NO同步監測）嵌入“Unisense電極”核心分析