Alanine cross-feeding determines Escherichia coli colony growth dynamics

丙氨酸交叉喂養決定大腸桿菌菌落生長動態

來源：bioRxiv Preprint · February 2021  DOI: 10.1101/2021.02.28.433255

 

一、摘要概述

 

本研究揭示了大腸桿菌菌落生物膜中丙氨酸交叉喂養的空間代謝機制。核心發現包括：

 

空間代謝分區：菌落底部厭氧區細胞（接觸富營養培養基）通過轉運蛋白AlaE分泌丙氨酸；中部需氧區細胞（營養匱乏）通過DadA/DadX利用丙氨酸作為碳氮源（圖2D-E）。

 

交叉喂養的生理效應：丙氨酸轉運缺失突變體（△alaE△dadAX）導致菌落中部細胞死亡率↑（圖4A），生長速率↓（圖5C），并改變菌落形態（圖5A-B）。

 

 

代謝梯度驅動：氧梯度（圖2A）和營養梯度共同塑造亞群分工，丙氨酸作為關鍵交叉喂養代謝物維持群落穩定性。

 

二、研究目的

 

無偏識別交叉喂養：通過時空多組學解析菌落生物膜中的代謝互作。

驗證丙氨酸的核心作用：探究其分泌與利用的空間調控機制。

闡明代謝互作對群落結構的貢獻：揭示丙氨酸交叉喂養如何影響菌落生長與細胞存活。

 

三、研究思路

 

采用 “多組學+空間分辨驗證” 策略：

 

表型觀察：

菌落生長動態（體積/高度/直徑）顯示24h為代謝轉換點（圖1B）。

 

全菌落轉錄組發現丙氨酸代謝基因（alaE, dadAX）顯著上調（圖1D）。

空間分辨機制解析：

氧梯度測量：Unisense微電極確認菌落內部缺氧區（圖2A）。

空間轉錄組：FACS分選熒光（需氧）與非熒光（厭氧）細胞，揭示alaE在厭氧區高表達，dadAX在需氧區高表達（圖2E）。

功能驗證：

代謝組證實厭氧條件下丙氨酸分泌（圖3A）。

 

基因敲除（△alaE△dadAX）導致菌落中部細胞死亡↑（圖4A）和生長缺陷（圖5C）。

 

四、關鍵數據及研究意義

1. 菌落生長與代謝動態（圖1）

 

數據來源：菌落形態測量（圖1B）、全菌落轉錄組（圖1C）、代謝組（圖1E-F）。

結果：

24h后生長速率下降（線性→指數轉換），伴隨966基因差異表達（圖1C）。

丙氨酸為唯一峰值出現在32h的氨基酸（圖1F）。

意義：確立代謝轉換時間點，鎖定丙氨酸為關鍵代謝物。

 

2. 空間代謝分區（圖2, 圖5）

 

數據來源：

Unisense氧微電極測量菌落氧梯度（圖2A）。

空間轉錄組（FACS分選+RNA-seq）（圖2E）。

菌落形態與生長速率成像（圖5A-C）。

結果：

氧濃度從表層200μM降至100μm深處接近0（圖2A）。

厭氧區alaE表達↑50倍，需氧區dadAX表達↑5倍（圖2E）。

△alaE△dadAX突變體菌落曲率↓30%（圖5B），生長速率↓40%（圖5C）。

意義：首次實現菌落內部代謝亞群的空間定位，證實代謝互作依賴微環境梯度。

 

3. 丙氨酸交叉喂養的功能（圖3-4）

 

數據來源：代謝組（圖3A, 4B）、細胞存活率（SYTOX染色）（圖4A）、生長曲線（圖4C-D）。

結果：

厭氧+富營養條件下丙氨酸分泌↑20倍（圖3A）。

△alaE△dadAX突變體胞外丙氨酸累積↑3倍（圖4B），細胞死亡率↑2.5倍（圖4A）。

外源丙氨酸抑制△alaE△dadAX生長（圖4C），靜止期死亡率↑80%（圖4D）。

意義：證明丙氨酸既是營養載體（碳氮源），又是毒性調節因子，缺失導致代謝失衡。

 

五、結論

 

代謝分區模型：菌落底部（厭氧）分泌丙氨酸 → 中部（需氧）消耗丙氨酸，形成空間代謝循環（圖5D）。

交叉喂養的生態功能：丙氨酸作為“代謝貨幣”維持營養匱乏區細胞存活，塑造菌落三維結構。

方法論創新：時空多組學+微電極技術為微生物群落代謝互作研究提供新范式。

 

六、丹麥Unisense電極數據的詳細解讀

1. 技術原理與實驗設計

 

原理：

Clark型微電極（25μm尖端）通過電化學還原反應實時測量溶解氧（μM級分辨率）。

兩點校準：空氣飽和水（高氧）vs. 抗壞血酸鈉（零氧）。

實驗設計：

垂直掃描72h菌落（5μm步進），每點測量3秒（圖2A）。

同步驗證：mRuby2熒光強度與氧濃度高度相關（R2=0.97）。

 

2. 關鍵結果（圖2A）

 

氧梯度特征：

表層（0-30μm）：氧濃度≈200 μM（近大氣飽和）。

中層（100μm）：氧濃度≈20 μM（缺氧閾值）。

深層（>150μm）：氧濃度≈0 μM（完全厭氧）。

生物學意義：

定量界定代謝分區：需氧區（<100μm）vs. 厭氧區（>100μm）。

解釋空間轉錄組結果：缺氧驅動alaE在深層表達，氧充足驅動dadAX在表層表達。

 

3. 研究價值

 

技術創新：克服傳統方法（如熒光染料）的光穿透限制，實現高分辨率原位氧測繪。

生物學啟示：

揭示菌落內部微米級代謝微環境異質性。

為理解生物膜中代謝互作的空間尺度提供直接證據。

 

七、研究意義

 

理論突破：

發現首個由單菌代謝分區驅動的交叉喂養案例（丙氨酸）。

提出“代謝梯度決定群落空間結構”新模型（圖5D）。

應用價值：

為調控生物膜（如抗生物膜策略）提供代謝靶點（如alaE抑制劑）。

啟示合成微生物群落的空間工程設計原則。

技術貢獻：

建立“微電極+空間組學”研究范式，可推廣至其他微生物體系。