Cooperation within the microbial consortia of fermented grains and pit mud drives organic acid synthesis in strong-flavor Baijiu production

發(fā)酵谷物和坑泥微生物聯(lián)盟內(nèi)部的合作推動(dòng)了濃香白酒生產(chǎn)中的有機(jī)酸合成

來源：Food Research International 147 (2021) 110449

 

一、摘要概述

 

本研究揭示了濃香型白酒發(fā)酵過程中酒醅（jiupei）與窖泥（pit mud）微生物群落的協(xié)同分工機(jī)制。通過監(jiān)測(cè)窖池內(nèi)環(huán)境參數(shù)（溫度、氧氣、pH）、代謝物（乙醇、有機(jī)酸）及微生物群落動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn)：

 

酒醅（酸性、高乙醇）以乳酸菌（Lactobacillus）為主導(dǎo)（末期占比98.0%），負(fù)責(zé)乳酸和乙酸合成；

窖泥（中性pH）以梭菌（Clostridia）為主（相對(duì)豐度42.9–85.5%），主導(dǎo)丁酸和己酸的生成；

分工機(jī)制：酒醅微生物產(chǎn)生的乳酸/乙酸被窖泥微生物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為風(fēng)味關(guān)鍵物質(zhì)（丁酸、己酸）。

意義：首次闡明窖池內(nèi)空間分區(qū)的微生物群落通過代謝接力驅(qū)動(dòng)白酒特征風(fēng)味的形成機(jī)制。

 

二、研究目的

 

解析風(fēng)味形成機(jī)制：明確酒醅與窖泥微生物在有機(jī)酸（乳酸、乙酸、丁酸、己酸）合成中的分工。

揭示群落協(xié)同規(guī)律：探究窖池內(nèi)不同空間（酒醅 vs 窖泥）微生物群落的演替與功能分化。

驗(yàn)證代謝分工假說：通過體外模擬發(fā)酵驗(yàn)證酒醅-窖泥微生物的代謝協(xié)作關(guān)系。

 

三、研究思路

 

采用 "原位監(jiān)測(cè)→群落分析→功能預(yù)測(cè)→體外驗(yàn)證" 策略：

 

原位動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)：

采集發(fā)酵過程（0–46天）酒醅與窖泥樣本（圖1）。

 

監(jiān)測(cè)環(huán)境參數(shù)（溫度、氧氣、pH）及代謝物（乙醇、有機(jī)酸）。

微生物群落解析：

qPCR和高通量測(cè)序分析細(xì)菌/真菌群落結(jié)構(gòu)（圖2）。

 

 

β-多樣性分析（PCoA/UPGMA）揭示群落分化（圖3）。

 

功能預(yù)測(cè)與驗(yàn)證：

PICRUSt預(yù)測(cè)代謝功能（圖5）。

 

體外雙模塊發(fā)酵驗(yàn)證分工機(jī)制（圖6）。

 

 

四、關(guān)鍵數(shù)據(jù)及其研究意義

1. 環(huán)境參數(shù)與代謝物動(dòng)態(tài)（圖1）

 

數(shù)據(jù)來源：圖1A–J（原位監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)）。

結(jié)果：

氧氣：酒醅在發(fā)酵5天后完全厭氧（Unisense電極測(cè)定），窖泥全程厭氧（圖1D）。

pH：酒醅酸性（pH 3.3–3.9），窖泥中性（pH 6.8–8.0）（圖1C）。

有機(jī)酸：乳酸（酒醅主導(dǎo)，28.8 mg/g） vs 丁酸/己酸（窖泥主導(dǎo)，濃度分別為酒醅的3倍/4倍）（圖1G–J）。

意義：證實(shí)酒醅與窖泥形成截然不同的微環(huán)境，驅(qū)動(dòng)微生物功能分化。

 

2. 微生物群落演替（圖2–4）

 

數(shù)據(jù)來源：圖2（qPCR/測(cè)序）、圖3（β-多樣性）、圖4（OTU共享網(wǎng)絡(luò)）。

結(jié)果：

細(xì)菌主導(dǎo)：細(xì)菌生物量是真菌的100倍（酒醅）至10,000倍（窖泥）（圖2A）。

群落分化：酒醅以Lactobacillus為主（98.0%），窖泥以Clostridia（Hydrogenispora等）為主（圖2B）。

物種遷移：酒醅與窖泥共享OTU（如OTU0:Lactobacillus），但豐度動(dòng)態(tài)相反（圖4C）。

意義：空間隔離導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)顯著分化（ANOSIM: R=0.858, P=0.001），支撐功能分工。

 

3. 代謝功能預(yù)測(cè)（圖5）

 

數(shù)據(jù)來源：圖5A–D（PICRUSt預(yù)測(cè)）。

結(jié)果：

酒醅：富集乳酸/乙酸合成酶（EC 1.1.1.28, EC 1.2.1.3）（圖5C）。

窖泥：富集丁酸/己酸合成酶（EC 2.7.2.7, EC 6.2.1.2）（圖5D）。

意義：從酶水平解釋酒醅產(chǎn)乳酸/乙酸、窖泥產(chǎn)丁酸/己酸的功能分化。

 

4. 體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（圖6）

 

數(shù)據(jù)來源：圖6B–E（雙模塊發(fā)酵）。

結(jié)果：

模塊1（酒醅）：產(chǎn)乳酸（27.9 g/L）和乙酸（2.0 g/L）（圖6B）。

模塊2（窖泥）：消耗乳酸生成丁酸（2.9 g/L）和己酸（圖6C）。

群落變化：窖泥模塊中Caproiciproducens（己酸生產(chǎn)者）豐度升至35.0%（圖6E）。

意義：直接驗(yàn)證"酒醅產(chǎn)酸→窖泥轉(zhuǎn)化"的代謝接力機(jī)制。

 

五、結(jié)論

 

微環(huán)境驅(qū)動(dòng)分工：酒醅（酸性/高乙醇）與窖泥（中性）塑造了差異化的微生物群落。

代謝功能分化：酒醅微生物合成乳酸/乙酸，窖泥微生物將其轉(zhuǎn)化為丁酸/己酸。

群落協(xié)同機(jī)制：通過物種遷移（如Lactobacillus）和代謝物交換（如乳酸）實(shí)現(xiàn)跨空間協(xié)作。

應(yīng)用價(jià)值：為調(diào)控白酒風(fēng)味品質(zhì)提供了微生物群落層面的理論依據(jù)。

 

六、丹麥Unisense電極數(shù)據(jù)的詳細(xì)解讀

1. 測(cè)量原理與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

 

技術(shù)原理：

Unisense OX-50微電極基于安培法，實(shí)時(shí)檢測(cè)溶解氧濃度（方法2.2）。

校準(zhǔn)：采用氧飽和PBS標(biāo)準(zhǔn)曲線（25°C）。

實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景：

監(jiān)測(cè)酒醅與窖泥在46天發(fā)酵中的氧氣動(dòng)態(tài)（圖1D）。

 

2. 關(guān)鍵結(jié)果與意義

 

數(shù)據(jù)來源：圖1D（原位氧氣變化曲線）。

結(jié)果：

酒醅：0–5天含氧（>0.5 mg/L），5天后降至厭氧狀態(tài)（<0.1 mg/L）。

窖泥：全程維持厭氧狀態(tài)（<0.1 mg/L）。

意義：

證實(shí)窖池密封性：氧氣快速消耗驗(yàn)證傳統(tǒng)泥窖的厭氧環(huán)境構(gòu)建能力。

解釋群落演替：酒醅早期需氧菌（如Acetobacter）豐度升高（圖2B），后期厭氧驅(qū)動(dòng)乳酸菌主導(dǎo)。

支撐代謝分工：窖泥嚴(yán)格厭氧環(huán)境是梭菌（丁酸/己酸生產(chǎn)者）活化的必要條件（圖5D）。

 

3. 研究?jī)r(jià)值

 

方法學(xué)優(yōu)勢(shì)：首次在白酒發(fā)酵中應(yīng)用微電極實(shí)現(xiàn)原位、實(shí)時(shí)氧監(jiān)測(cè)，避免取樣干擾。

機(jī)制闡釋：氧氣動(dòng)態(tài)直接關(guān)聯(lián)微生物群落演替（如Acetobacter在酒醅早期的快速生長(zhǎng)與耗氧相關(guān)）。

工藝優(yōu)化指導(dǎo)：證實(shí)前5天為微需氧窗口期，可通過調(diào)控氧氣影響風(fēng)味前體合成。

 

七、研究意義

 

理論創(chuàng)新：提出"窖池空間分區(qū)微生物代謝接力"模型，突破單一群落研究的局限。

技術(shù)應(yīng)用：Unisense電極監(jiān)測(cè)為傳統(tǒng)發(fā)酵工藝的精準(zhǔn)調(diào)控提供新工具。

產(chǎn)業(yè)價(jià)值：通過調(diào)控酒醅-窖泥微生物協(xié)作，可定向增強(qiáng)白酒特征風(fēng)味（如己酸乙酯）。