Regulation of Inflammatory Response and Osteogenesis to Citrate-Based Biomaterials through Incorporation of Alkaline Fragments

通過摻入堿性片段調節檸檬酸鹽生物材料的炎癥反應和成骨作用

來源：Adv. Healthcare Mater. 2022, 11, 2101590

 

一、摘要概述

 

本文針對檸檬酸鹽基生物材料（如POC）降解過程中釋放檸檬酸導致微環境酸化的問題，設計了一種新型堿性片段BHEp改性的聚檸檬酸酯（POPC）。通過將BHEp引入聚(檸檬酸-1,8-辛二醇)（POC）主鏈，合成POPC聚合物，并與β-磷酸三鈣（β-TCP）復合制備3D打印多孔支架（PTCP）。研究證實：

 

堿性中和作用：BHEp有效中和降解產生的酸性環境（圖3f），將pH穩定在7.0-7.2（生理范圍）。

 

 

細胞行為改善：POPC15（15% BHEp）顯著促進rBMSCs黏附、增殖及成骨基因表達（圖6b-c），并降低巨噬細胞炎癥反應（圖7e）。

 

 

 

骨再生增強：大鼠股骨缺損模型中，PTCP15支架顯著提升新骨形成（圖8）與骨整合（圖9）。

 

 

 

研究為調控生物材料降解微環境提供了新策略。

 

二、研究目的

 

解決降解酸化問題：傳統檸檬酸鹽材料（如POC）降解釋放檸檬酸，導致pH下降（<6.5），抑制細胞活性與骨再生。

 

優化材料性能：通過引入堿性片段BHEp，中和酸性微環境，改善生物相容性。

 

驗證骨修復效果：評估POPC/β-TCP支架在體外（細胞響應）和體內（骨缺損修復）的作用機制。

 

三、研究思路

 

采用 “材料設計→性能表征→生物學評價→動物驗證” 四步策略：

 

材料合成：

 

以檸檬酸、1,8-辛二醇和BHEp為單體，通過縮聚反應合成POPC預聚物（圖1a）。

 

 

經后聚合得到POPC彈性體，并與β-TCP復合，3D打印多孔支架（圖5a）。

 

 

性能表征：

 

化學結構（FTIR/NMR，圖2a,d）、熱力學性質（DSC/TGA，圖3a）、機械性能（圖3b）、溶脹與降解行為（圖3c,e）。

 

體外生物學評價：

 

細胞相容性（CCK-8，圖4a）、rBMSCs成骨分化（RT-qPCR/Western blot，圖6）、巨噬細胞炎癥響應（流式細胞術/RT-qPCR，圖7）。

 

 

體內骨再生驗證：

 

大鼠股骨缺損模型，通過Micro-CT（圖8）和組織學（圖9）評估新骨形成。

 

四、關鍵數據及其研究意義

1. 材料性能數據（圖3）

 

數據來源：圖3a-f（熱力學、機械、溶脹、降解、pH）。

 

關鍵結果：

 

POPC15的pH穩定性最佳（Tris緩沖液中穩定于7.2，圖3f）。

 

降解9周后POPC15失重僅40%，低于POC的80%（圖3e）。

 

研究意義：

 

BHEp通過質子化中和檸檬酸（圖1b），避免pH驟降，為細胞提供適宜微環境。

 

適度的BHEp含量（15%）平衡了機械強度與降解速率（彈性模量10.46 MPa，圖3b）。

 

2. 細胞響應數據（圖4, 6, 7）

 

數據來源：

 

圖4a（細胞增殖）、圖6b-c（成骨基因/蛋白表達）、圖7e（炎癥基因表達）。

 

關鍵結果：

 

rBMSCs在POPC15提取物中增殖率最高（CCK-8，圖4a）。

 

成骨基因（Runx2, OPN, Col I）表達上調2-3倍（圖6b）。

 

巨噬細胞促炎基因（IL-1β, TNF-α）下調，抗炎基因（IL-10）上調（圖7e）。

 

研究意義：

 

中性pH微環境促進rBMSCs成骨分化，并誘導巨噬細胞向促愈合表型（M2型）極化。

 

證實材料表面電荷（BHEp質子化后帶正電）增強細胞黏附（接觸角49.5°，圖3d）。

 

3. 動物實驗數據（圖8, 9）

 

數據來源：圖8（Micro-CT）、圖9（組織學）。

 

關鍵結果：

 

PTCP15組骨礦物密度（BMD）和骨體積分數（BV/TV）顯著高于對照組（*p<0.05，圖8b）。

 

8周時缺損區形成成熟骨板（哈弗斯系統，圖9）。

 

研究意義：

 

堿性微環境協同多孔結構促進血管化骨再生，為臨床骨缺損修復提供新材料。

 

五、結論

 

材料創新性：BHEp的引入解決了檸檬酸鹽材料降解酸化的核心問題，POPC15的綜合性能最優。

 

機制明確：

 

pH緩沖：BHEp通過質子化中和H?，維持微環境pH>7.0（圖3f）。

 

免疫調節：降低促炎因子表達，促進巨噬細胞向M2型轉化（圖7c-e）。

 

應用價值：PTCP15支架顯著增強骨再生（圖8-9），為骨組織工程提供新策略。

 

六、丹麥Unisense電極數據的詳細解讀

1. 技術優勢

 

高精度動態監測：

 

電極尖端直徑10 μm（響應時間1-3秒），實現 微區pH實時追蹤（圖3f, 5c）。

 

直接輸出絕對pH值（非間接熒光法），避免自發熒光成像的定量偏差。

 

2. 關鍵數據意義（圖3f, 5c）

 

降解初期pH調控：

 

在Tris緩沖液中，POPC15的pH在12小時內從7.0升至7.2，而POC驟降至7.2以下（圖3f）。

 

證明BHEp的即時中和能力：質子化叔胺基團（R?N + H? → R?NH?）消耗H?。

 

生理環境驗證：

 

在無血清培養基中，PTCP15支架維持pH>7.0長達7天（圖5c），克服傳統材料在復雜體液環境的不穩定性。

 

3. 研究突破

 

定量關聯材料化學與生物學響應：

 

Unisense數據直接關聯BHEp含量（15%）與pH穩定性（圖3f），解釋細胞增殖差異（圖4a）。

 

揭示 “堿性片段→pH緩沖→細胞行為改善” 的因果鏈條（圖1b, 3f, 4a）。

 

技術不可替代性：

 

傳統pH試紙或熒光法無法實現秒級動態監測，Unisense電極為降解動力學研究提供關鍵工具。

 

總結：本研究通過Unisense電極精準量化POPC的pH緩沖能力，證實堿性片段BHEp是調控骨修復微環境的核心要素。其數據不僅解釋了材料降解的化學機制（H?中和），更將材料性能與生物學效應（細胞增殖、成骨分化、炎癥調控）直接關聯，為設計下一代智能骨修復材料奠定基礎。