Visualization of mRNA Expression in Pseudomonas aeruginosa Aggregates Reveals Spatial Patterns of Fermentative and Denitrifying Metabolism

銅綠假單胞菌聚集體中 mRNA 表達(dá)的可視化揭示了發(fā)酵和反硝化代謝的空間模式

來(lái)源：Applied and Environmental Microbiology June 2022 Volume 88 Issue 11

 

摘要核心內(nèi)容

 

研究利用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR v3.0） 技術(shù)實(shí)現(xiàn)了銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜內(nèi)代謝基因的單細(xì)胞級(jí)空間可視化：

 

開(kāi)發(fā)新型探針：針對(duì)呼吸（ccoN1）、反硝化（narG, nirS, nosZ）和發(fā)酵（ackA）基因設(shè)計(jì)特異性探針（圖2驗(yàn)證）；

 

揭示代謝分區(qū)：生物膜聚集體內(nèi)存在明確代謝分區(qū)——有氧區(qū)（表層）高表達(dá)ccoN1，缺氧區(qū)（中層）富集反硝化基因，無(wú)氧核心（深層）激活發(fā)酵基因ackA（圖3）；

 

 

技術(shù)突破：首次在不依賴基因編輯條件下實(shí)現(xiàn)多代謝途徑的空間共定位，分辨率達(dá)單細(xì)胞水平。

 

研究目的

 

開(kāi)發(fā)非侵入式空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，解析生物膜微環(huán)境異質(zhì)性；

闡明氧梯度對(duì)銅綠假單胞菌代謝分區(qū)的調(diào)控機(jī)制；

建立基因表達(dá)-微環(huán)境關(guān)聯(lián)模型，為生物膜耐藥性研究提供新視角。

 

研究思路

 

探針設(shè)計(jì)與驗(yàn)證：

設(shè)計(jì)ccoN1（細(xì)胞色素c氧化酶）、narG（硝酸鹽還原酶）、nirS（亞硝酸鹽還原酶）、nosZ（氧化亞氮還原酶）、ackA（乙酸激酶）的HCR探針（表1）；

 

 

通過(guò)基因敲除株驗(yàn)證探針特異性（圖2A-D）。

生物膜模型構(gòu)建：

采用瓊脂塊生物膜分析法（ABBA），在LB+40mM硝酸鹽中培養(yǎng)12小時(shí)（圖3A）；

使用丹麥Unisense微電極測(cè)量氧梯度（圖3A）。

空間轉(zhuǎn)錄組分析：

雙通道HCR成像：16S rRNA（青色）標(biāo)記細(xì)胞活性，mRNA（品紅）標(biāo)記目標(biāo)基因；

量化聚集體內(nèi)基因表達(dá)強(qiáng)度與空間分布（圖3B-C）。

 

關(guān)鍵數(shù)據(jù)及研究意義

1. 探針特異性驗(yàn)證（圖2）

 

數(shù)據(jù)來(lái)源：野生型與突變株的熒光強(qiáng)度對(duì)比。

核心發(fā)現(xiàn)：

野生株熒光強(qiáng)度比突變株高10倍（narG, nirS, nosZ, ccoN1）或2倍（ackA）；

非特異性結(jié)合可忽略（背景熒光點(diǎn)與細(xì)胞不重疊）。

研究意義：為空間定位提供高信噪比工具，避免假陽(yáng)性干擾。

 

2. 氧梯度與基因表達(dá)空間關(guān)聯(lián)（圖3）

 

數(shù)據(jù)來(lái)源：Unisense氧電極測(cè)量ABBA氧梯度（圖3A），HCR成像量化基因表達(dá)。

核心發(fā)現(xiàn)：

0-50μm（有氧區(qū)）：ccoN1表達(dá)最強(qiáng)（PCC=0.956 vs 16S rRNA），ackA在聚集體核心激活；

50-150μm（缺氧區(qū)）：narG峰值（聚集體內(nèi)部），nirS擴(kuò)散至整個(gè)聚集體；

>150μm（無(wú)氧區(qū)）：nirS持續(xù)高表達(dá)，nosZ零星出現(xiàn)。

研究意義：證實(shí)氧梯度驅(qū)動(dòng)代謝分區(qū)，反硝化基因表達(dá)受一氧化氮信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)控。

 

3. 代謝路徑的空間解耦（圖4）

4. 

 

數(shù)據(jù)來(lái)源：基因表達(dá)與16S rRNA相關(guān)性分析。

核心發(fā)現(xiàn)：

ccoN1與細(xì)胞活性強(qiáng)正相關(guān)（基礎(chǔ)代謝），ackA在低氧高活性區(qū)特異激活；

反硝化基因（narG, nosZ）與細(xì)胞活性弱相關(guān)（PCC=0.612-0.678），受微環(huán)境特異性誘導(dǎo)。

研究意義：揭示發(fā)酵與反硝化的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系——缺氧區(qū)富集硝酸鹽時(shí)反硝化主導(dǎo)，無(wú)氧核心轉(zhuǎn)向發(fā)酵。

 

結(jié)論

 

代謝分區(qū)機(jī)制：

生物膜表層：有氧呼吸（ccoN1高表達(dá)）；

中層過(guò)渡區(qū)：反硝化主導(dǎo)（narG→nirS→nosZ級(jí)聯(lián)激活）；

深層無(wú)氧核心：發(fā)酵途徑（ackA維持ATP合成）。

技術(shù)應(yīng)用價(jià)值：

HCR v3.0實(shí)現(xiàn)多基因空間共定位，規(guī)避遺傳修飾需求；

為臨床生物膜（如囊性纖維化肺部感染）的代謝異質(zhì)性研究提供新工具。

 

丹麥Unisense電極的研究意義

技術(shù)原理與數(shù)據(jù)作用

 

微米級(jí)氧測(cè)繪：Clark型電極（尖端25μm）以25μm步進(jìn)掃描ABBA氧梯度（圖3A）；

校準(zhǔn)方法：無(wú)氧（0.1M NaOH+抗壞血酸鈉）vs 空氣飽和LB溶液雙點(diǎn)校準(zhǔn)；

關(guān)鍵數(shù)據(jù)：

0-50μm溶解氧>80%空氣飽和度；

150-250μm降至<5%，確立缺氧/無(wú)氧邊界。

 

研究?jī)r(jià)值

 

微環(huán)境定量關(guān)聯(lián)：

氧梯度數(shù)據(jù)與HCR成像空間匹配，證實(shí)ccoN1表達(dá)衰減與氧濃度下降同步（R2=0.92）；

解釋ackA在深層激活的生理基礎(chǔ)（氧<2%時(shí)發(fā)酵途徑競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)）。

反硝化動(dòng)力學(xué)驗(yàn)證：

中層缺氧區(qū)（50-150μm）narG峰值與氧電極測(cè)量的臨界氧閾（5%-10%） 一致；

支持反硝化基因受Anr/Dnr轉(zhuǎn)錄因子級(jí)聯(lián)調(diào)控的模型（圖1）。

 

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

高空間分辨率：25μm步進(jìn)精度捕獲聚集體邊緣-核心梯度；

實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)：秒級(jí)響應(yīng)，避免固定樣本的氧擴(kuò)散失真。

 

與傳統(tǒng)方法的對(duì)比

參數(shù) Unisense微電極 熒光蛋白報(bào)告基因

空間分辨率 25μm ＞100μm（擴(kuò)散限制）

微環(huán)境影響 零干擾 可能改變細(xì)胞生理

多參數(shù)同步 氧+代謝成像共定位 僅限遺傳編碼目標(biāo)

適用模型 天然菌株/復(fù)雜樣本 依賴遺傳操作

應(yīng)用前景

 

臨床生物膜研究：解析感染病灶中病原體的代謝異質(zhì)性，指導(dǎo)靶向治療；

環(huán)境微生物學(xué)：揭示土壤/水體生物膜的氮循環(huán)空間動(dòng)力學(xué)；

合成生物學(xué)：優(yōu)化工程菌群的空間代謝分工設(shè)計(jì)。

 

突破性價(jià)值：通過(guò)Unisense電極的氧梯度定量與HCR空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)合，首次在單細(xì)胞水平建立氧微環(huán)境-代謝基因表達(dá)的定量關(guān)聯(lián)模型，為生物膜耐藥機(jī)制研究提供方法論范式。