Self-oxygenation of engineered living tissues orchestrates osteogenic commitment of mesenchymal stem cells

工程化活組織的自氧合協(xié)調(diào)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨承諾

來源：Biomaterials 300 (2023) 122179

 

一、摘要核心內(nèi)容

本研究開發(fā)了一種基于過氧化鈣（CPO）的產(chǎn)氧微顆粒（OMPs），并將其整合到甲基丙烯酰化明膠（GelMA）水凝膠中，用于改善缺氧微環(huán)境下人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）的成骨分化。核心發(fā)現(xiàn)包括：

OMPs的持續(xù)供氧能力：通過聚己內(nèi)酯（PCL）包封CPO實(shí)現(xiàn)長效氧釋放（14天），緩解缺氧壓力。

缺氧條件下的成骨增強(qiáng)：OMP水凝膠在常氧（5%O?）和嚴(yán)重缺氧（<0.2%O?）環(huán)境下均顯著提升hMSCs的成骨標(biāo)志物表達(dá)（ALP、OCN、OPN）和鈣沉積。

協(xié)同效應(yīng)：OMPs與成骨誘導(dǎo)性硅酸鹽納米顆粒（SNPs）聯(lián)用（SNP/OMP水凝膠）在體內(nèi)促進(jìn)血管生成和宿主細(xì)胞浸潤，加速骨組織再生。

機(jī)制解析：RNA測序表明OMPs通過上調(diào)BMP6、CTNNB1等基因激活成骨通路，且缺氧環(huán)境增強(qiáng)其促分化效應(yīng)。

二、研究目的

解決缺氧問題：克服大尺寸骨移植物因缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞死亡和再生失敗。

優(yōu)化材料設(shè)計(jì)：開發(fā)可控釋氧的OMPs，驗(yàn)證其對(duì)hMSCs成骨分化的影響。

探索協(xié)同機(jī)制：比較OMPs、SNPs及兩者聯(lián)用對(duì)成骨分化的調(diào)控作用。

驗(yàn)證臨床應(yīng)用潛力：通過皮下植入模型評(píng)估材料降解、血管生成及骨形成能力。

三、研究思路

材料制備：

合成CPO-PCL微顆粒（OMPs；粒徑4.2±1.7μm，圖1A）。

構(gòu)建三種GelMA水凝膠：OMP水凝膠（0.25%OMP）、SNP水凝膠（0.05%SNP）、SNP/OMP水凝膠（0.05%SNP+0.25%OMP）。

體外實(shí)驗(yàn)：

力學(xué)與降解：測試水凝膠壓縮模量（45-55 kPa，圖1B）、孔隙結(jié)構(gòu)（SEM，圖1C-D）及酶降解動(dòng)力學(xué)（圖1E）。

氧/過氧化氫釋放：Unisense電極監(jiān)測氧濃度（圖1F）和H?O?水平（圖1G）。

細(xì)胞行為：在常氧/缺氧下評(píng)估hMSCs存活、增殖（Live/Dead染色，圖2）及成骨分化（ALP活性、鈣沉積、基因表達(dá)，圖3）。

體內(nèi)驗(yàn)證：

大鼠皮下植入水凝膠，分析宿主細(xì)胞浸潤、血管生成（CD31+染色，圖5）及免疫反應(yīng)（CD86+/CD206+巨噬細(xì)胞）。

四、測量數(shù)據(jù)及研究意義

材料表征數(shù)據(jù)（圖1）

O?釋放曲線（圖1F）：OMP水凝膠持續(xù)釋氧14天（0.31μM），而SNP/OMP組因SNP吸附O?導(dǎo)致釋氧量降低（<0.2μM）。

意義：揭示SNPs的氧氣吸附特性，指導(dǎo)復(fù)合材料設(shè)計(jì)以優(yōu)化供氧。

H?O?釋放（圖1G）：OMP組H?O?濃度<30μM（低于細(xì)胞毒性閾值）。

意義：證實(shí)PCL包封有效控制CPO水解，避免氧化損傷。

細(xì)胞存活與分化（圖2-3）

 

缺氧下存活率（圖2D）：SNP組細(xì)胞存活率<50%，而OMP/SNP-OMP組>90%。

意義：OMPs通過供氧逆轉(zhuǎn)SNPs在缺氧下的細(xì)胞毒性。

ALP活性（圖3B）：缺氧下SNP/OMP組ALP活性比SNP組高3倍。

意義：OMPs與SNPs協(xié)同增強(qiáng)早期成骨分化。

鈣沉積（圖3I）：SNP/OMP組在缺氧下鈣沉積量顯著高于SNP組。

意義：自供氧環(huán)境促進(jìn)基質(zhì)礦化。

基因調(diào)控（圖4）

 

RNA測序（圖4E-F）：缺氧下OMP組上調(diào)BMP6、CTNNB1（Wnt通路）、HES1等成骨基因。

意義：闡明氧氣通過激活BMP/Wnt通路驅(qū)動(dòng)成骨分化。

體內(nèi)血管化（圖5）

 

 

CD31+血管密度（圖5E）：SNP/OMP組血管數(shù)量顯著高于其他組。

意義：OMPs加速移植物血管化，縮短植入體缺氧期。

五、丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的研究意義

檢測目標(biāo)：

溶解氧濃度：使用Unisense Opto-F1光纖氧傳感器監(jiān)測水凝膠中O?釋放動(dòng)力學(xué)（方法2.5.3）。

校準(zhǔn)方法：兩點(diǎn)校準(zhǔn)（空氣飽和PBS vs.氮?dú)饷撗鮌BS）確保數(shù)據(jù)可靠性。

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)與意義：

精準(zhǔn)量化釋氧性能：

首次證實(shí)SNPs吸附氧氣（SNP/OMP組釋氧量<0.2μM），揭示材料交互作用對(duì)供氧的影響（圖1F）。

意義：為優(yōu)化復(fù)合材料的氧氣控釋策略提供直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

支持細(xì)胞代謝需求：

 

OMP組維持0.31μM O?達(dá)14天，滿足hMSCs在缺氧下的存活與分化需求（圖2D,3B）。

意義：明確OMPs作為“人工線粒體”的功能，為臨床大尺寸移植物設(shè)計(jì)提供參數(shù)依據(jù)。

技術(shù)優(yōu)勢：

高時(shí)空分辨率：實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測局部氧濃度變化，克服傳統(tǒng)終點(diǎn)檢測的局限性。

意義：建立標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)估體系，推動(dòng)產(chǎn)氧材料在組織工程中的應(yīng)用。

六、結(jié)論

材料創(chuàng)新：CPO-PCL微顆粒實(shí)現(xiàn)長效、可控供氧，H?O?釋放低于毒性閾值。

成骨增強(qiáng)機(jī)制：

OMPs通過上調(diào)BMP6/CTNNB1通路促進(jìn)成骨分化，缺氧環(huán)境進(jìn)一步放大該效應(yīng)。

SNPs在缺氧下抑制細(xì)胞活性，而OMPs逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)并協(xié)同增強(qiáng)礦化。

臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值：

SNP/OMP水凝膠在體內(nèi)促進(jìn)血管生成（CD31+↑）和宿主整合，加速骨再生。

縮短移植物預(yù)血管化周期，為臨界骨缺損修復(fù)提供新策略。