Mitochondrial rewiring drives metabolic adaptation to NAD(H) shortage in triple negative breast cancer cells  

線粒體重新布線驅動三陰性乳腺癌細胞對 NADH短缺的代謝適應

期刊：Neoplasia  

來源：ScienceDirect (DOI: https://doi.org/10.1016/j.neo.2023.100903)  

 

摘要核心內容

 

本研究探討三陰性乳腺癌（TNBC）細胞對NAMPT抑制劑FK866耐藥的代謝適應機制。通過建立FK866耐藥細胞模型（MDA-MB-231 RES），研究發現：  

耐藥機制獨立于經典藥泵外排或補償性NAD?合成通路（如NMRK1），而依賴線粒體代謝重組。  

 

線粒體功能增強：耐藥細胞線粒體備用呼吸能力（SRC）、線粒體質量（mtDNA/nDNA比例增加）及生物合成（PGC-1α/TFAM上調）顯著提升。  

 

代謝底物依賴性改變：耐藥細胞更依賴丙酮酸和琥珀酸氧化供能，且線粒體丙酮酸載體MPC2的抑制可誘導敏感細胞產生類耐藥表型。  

 

關鍵結論：持續NAD(H)短缺驅動線粒體重編程，通過增強氧化磷酸化（OXPHOS）和底物靈活性（丙酮酸→琥珀酸轉換）維持能量穩態，導致FK866耐藥。  

 

研究目的

 

探究TNBC細胞對NAMPT抑制劑FK866耐藥的分子機制，重點關注線粒體代謝適應在抵抗NAD(H)短缺中的作用，為克服耐藥提供新靶點。  

 

研究思路

 

模型建立：  

 

通過長期遞增FK866暴露，構建MDA-MB-231耐藥細胞系（RES）。  

耐藥機制初篩：  

 

排除NAMPT突變、藥泵外排（ABCB1/ABCC1）及補償性NAD?合成通路（NMRK1沉默驗證）。  

線粒體功能聚焦：  

 

Seahorse分析糖酵解率（GlycoPER）和線粒體呼吸功能（OCR）。  

 

評估線粒體質量（mtDNA/nDNA比例、MitoTracker染色）、生物合成基因（PGC-1α/TFAM）及底物依賴性（Mitoplate S-1）。  

關鍵靶點驗證：  

 

藥理學（UK5099/羅格列酮抑制MPC）和遺傳學（siRNA沉默MPC1/MPC2）干預，結合FK866處理。  

 

呼吸鏈復合物活性及ATP合成酶功能檢測。  

機制整合：  

 

解析丙酮酸→琥珀酸代謝轉換在維持膜電位（Δψm）和能量供應中的作用。  

 

測量數據及其意義

 

（1）耐藥表型與機制排除（圖1）

數據：RES細胞對FK866完全耐藥（EC??不可計算），但對化療藥物（5FU、順鉑）敏感；Verapamil/CsA處理不逆轉耐藥；ABCB1/ABCC1表達無差異。  

 

意義：耐藥非經典藥泵介導，提示代謝適應主導。  

來源：圖1A-G。  

 

（2）NAD?合成通路無補償作用（圖2）

數據：RES細胞NAMPT/NAPRT下調、NMRK1上調，但NMRK1沉默不增敏FK866；NAD(H)/ATP水平不變。  

 

意義：補償性NAD?合成非關鍵耐藥機制。  

 

來源：圖2B-H。  

 

（3）線粒體功能增強（圖3）

數據：  

 

RES細胞備用呼吸容量（SRC） 顯著升高（Seahorse OCR）。  

 

線粒體質量增加：mtDNA/nDNA比例↑、TOMM20蛋白↑、PGC-1α/TFAM轉錄上調、MitoTracker熒光強度↑2倍。  

 

意義：線粒體生物合成與功能擴容是核心適應策略。  

 

來源：圖3A-G。  

 

（4）代謝底物依賴性轉變（圖4）

數據：Mitoplate分析顯示RES細胞對丙酮酸+低劑量蘋果酸氧化速率↑；UK5099（MPC抑制劑）降低RES細胞最大呼吸。  

 

意義：耐藥細胞依賴丙酮酸作為碳源，MPC介導的丙酮酸輸入至關重要。  

 

來源：圖4A-C。  

 

（5）MPC2抑制誘導類耐藥表型（圖5）

數據：  

 

UK5099/羅格列酮聯合FK866提升敏感細胞存活率。  

 

MPC2沉默（非MPC1）部分挽救FK866導致的細胞死亡和ATP耗竭。  

 

意義：MPC2功能抑制模擬耐藥表型，驗證其介導代謝適應的必要性。  

 

 

來源：圖5A-D。  

 

（6）琥珀酸依賴性與能量維持（圖6）

數據：  

 

呼吸鏈復合物I-IV活性無差異，但ATP合成酶活性在FK866+UK5099處理下RES細胞更高。  

 

丹麥Unisense微電極數據：RES細胞在丙酮酸剝奪（UK5099）下，琥珀酸氧化耗氧率（OCR） 顯著高于敏感細胞（圖6G）。  

 

意義：耐藥細胞通過琥珀酸氧化維持膜電位（Δψm）和ATP合成，提供代謝靈活性。  

 

來源：圖6A-G。  

 

研究結論

 

線粒體代謝重組是耐藥核心：FK866持續暴露誘導線粒體生物合成（質量↑）和功能擴容（SRC↑），增強OXPHOS能力。  

 

底物靈活性驅動適應：耐藥細胞從丙酮酸依賴轉向琥珀酸高效利用（Unisense數據證實），維持能量穩態。  

 

MPC2是關鍵調控點：抑制MPC2（非MPC1）誘導敏感細胞產生類耐藥表型，靶向MPC2或可逆轉化療耐藥。  

 

丹麥Unisense微電極數據的詳細解讀

 

測量方法與結果（圖6G）

技術原理：Unisense微電極通過實時耗氧率（OCR） 檢測，評估線粒體底物氧化效率。細胞經皂苷透化后，分別提供：  

 

丙酮酸+蘋果酸（激活復合物I通路）。  

 

琥珀酸+魚藤酮（激活復合物II通路，抑制復合物I）。  

 

關鍵發現：  

 

耐藥細胞琥珀酸OCR更高：RES細胞在琥珀酸底物下OCR顯著高于PAR細胞（*p<0.01），表明其增強琥珀酸氧化能力。  

 

代謝靈活性：UK5099抑制丙酮酸輸入后，RES細胞仍通過琥珀酸維持高OCR；FK866處理不影響其琥珀酸利用效率。  

 

敏感細胞的補償失敗：PAR細胞在丙酮酸剝奪后琥珀酸OCR無代償性提升，且FK866進一步抑制呼吸功能。  

 

研究意義

揭示代謝可塑性：Unisense數據首次直接證明耐藥細胞通過琥珀酸氧化繞過丙酮酸短缺，維持線粒體呼吸，解釋其能量供應韌性。  

 

提供耐藥新靶點：琥珀酸代謝途徑（如復合物II）或可成為克服NAMPT抑制劑耐藥的新干預方向。  

 

技術優勢：Unisense微電極提供實時動態呼吸功能數據，彌補Seahorse靜態分析的不足，精準捕捉底物轉換的代謝適應性。  

 

總結：本研究闡明TNBC細胞通過線粒體重編程（生物合成增強、底物靈活性提升）抵抗NAD(H)短缺導致的FK866毒性。丹麥Unisense微電極數據為核心機制（琥珀酸依賴）提供直接證據，為靶向線粒體代謝逆轉耐藥提供理論依據。