Proteomic analysis of metronidazole resistance in the human facultative pathogen Bacteroides fragilis  

人兼性病原菌 Bacteroides fragilis 中甲硝唑耐藥性的蛋白質組學分析

期刊：Frontiers in Microbiology (Volume 14, 2023)  

 

摘要核心內容

 

本研究通過定量質譜蛋白質組學分析，探究了Bacteroides fragilis中甲硝唑耐藥性的機制，重點關注nimA基因的作用。研究發現：  

無nimA菌株（638R） 的高水平耐藥（638RR）與血紅素/鐵離子攝取蛋白下調（如HmuY、TonB受體）密切相關，導致鐵依賴酶（如PFOR）失活。  

 

含nimA菌株（638R nimA） 的耐藥性（638R nimAR）僅引起少量蛋白變化，且FprA（黃素鐵氧還蛋白）持續上調，但過表達FprA不直接賦予耐藥性。  

 

鐵補充實驗證實：638RR的耐藥性可被100μM硫酸亞鐵部分逆轉（MIC從>256降至4μg/mL），而638R nimAR無此現象。  

 

Unisense氧微電極檢測顯示耐藥菌的氧清除能力下降50%，表明氧化應激防御受損。  

 

研究目的

闡明nimA基因（傳統認為編碼硝基還原酶）在介導甲硝唑高水平耐藥中的作用機制。  

 

比較含/不含nimA基因的菌株在耐藥誘導過程中的蛋白質組差異。  

 

探究耐藥性與鐵代謝、氧化應激途徑的關聯。  

 

研究思路

菌株構建：  

 

基礎菌株：B. fragilis 638R（無nim基因）及其轉接合子638R nimA（含nimA質粒）。  

 

耐藥誘導：通過逐步增加甲硝唑濃度（至64μg/mL），獲得高水平耐藥株638RR和638R nimAR。  

蛋白質組分析：  

 

定量質譜（nanoHPLC-MS/MS）比較四組菌株：638R vs. 638R nimA；638R vs. 638RR；638R nimA vs. 638R nimAR。  

 

篩選標準：差異≥2倍且p<0.01。  

功能驗證：  

 

FprA過表達：構建638R pFDfprA，通過RT-qPCR和藥敏試驗驗證其作用。  

 

氧清除能力：使用Unisense氧微電極監測細胞耗氧動力學。  

 

鐵補充試驗：在含100μM FeSO4平板上測試甲硝唑MIC變化。  

 

測量數據與研究意義

蛋白質組差異（表1-4, 圖1）

 

638R vs. 638R nimA：  

 

僅5種蛋白持續差異表達（表2），包括FprA上調12.9倍（抗氧化酶）。  

 

意義：nimA可能通過間接調控（如代謝重編程）影響耐藥性，而非直接降解甲硝唑。  

 

638R vs. 638RR：  

 

237種差異蛋白（圖1A），核心變化：  

 

血紅素轉運蛋白下調（HmuY: -509倍, TonB受體: -77倍）（表3）→ 鐵限制→ 鐵依賴酶失活。  

 

RND外排泵上調（如BmeAB5: +9.1倍）（表4）→ 藥物外排增強。  

 

核糖體蛋白普遍上調→ 可能增強損傷修復能力。  

 

意義：無nimA菌株通過“鐵饑餓”策略實現耐藥，但犧牲代謝效率（生長受損）。  

 

638R nimA vs. 638R nimAR：  

 

僅41種差異蛋白，且無共同耐藥相關通路。  

 

意義：nimA存在時，耐藥進化更“高效”，無需大規模蛋白重組。  

FprA過表達驗證（圖2）

 

過表達菌株（638R pFDfprA）的甲硝唑MIC未升高（0.125 vs. 0.25μg/mL）。  

 

意義：FprA上調是耐藥伴隨現象，而非直接原因。  

氧清除能力（表5）

 

耐藥菌耗氧速率下降50%（638RR: 37% → 53%；638R nimAR: 33% → 62%）。  

 

意義：耐藥菌抗氧化能力受損，與鐵限制或代謝途徑改變相關。  

鐵補充試驗（圖3）

 

638RR：添加Fe2+后MIC從>256降至4μg/mL（圖3A）。  

 

638R nimAR：Fe2+補充無逆轉效應（MIC>256μg/mL）（圖3B）。  

 

意義：無nimA菌株的耐藥性高度依賴鐵限制策略。  

 

Unisense微電極數據的深度解析

 

技術原理與創新性

設備組成：  

 

OX-500微電極（Unisense, Denmark）：針式傳感器（直徑≈500μm），直接插入樣本實時監測溶解氧。  

 

高靈敏度皮安計（Unisense Microsensor Monometer）：檢測電極電流變化（nA級），換算為氧濃度。  

 

專用軟件（SensorTrace SUITE）：每30秒自動記錄數據，生成動力學曲線。  

 

校準方法：  

 

  使用氧飽和水建立標準曲線，確保活體檢測準確性。  

實驗設計：  

 

將2×109細菌懸浮于氧飽和BHI培養基，密封于玻璃管。  

 

微電極插入液相，監測60分鐘內氧濃度變化（背景扣除培養基自身耗氧）。  

 

研究意義

量化耐藥菌的生理缺陷：  

 

首次證實耐藥菌氧清除速率下降50%（表5），直接關聯到：  

 

鐵依賴酶（如細胞色素bd氧化酶）功能受損。  

 

抗氧化防御系統崩潰，加劇甲硝唑敏感度（因甲硝唑激活需嚴格厭氧環境）。  

揭示代謝重編程機制：  

 

氧清除能力保留但速率降低→ 暗示耐藥菌通過下調高耗能途徑（如電子傳遞鏈）維持生存，與蛋白質組數據中能量代謝酶變化吻合（表3）。  

 

技術優勢：  

 

原位實時監測：避免傳統終點法（如溶氧試劑）的破壞性采樣誤差。  

 

高時空分辨率：30秒/次的數據頻率捕捉動態過程，優于勻漿法。  

 

活體兼容性：直接應用于細菌懸浮液，無需裂解細胞。  

 

局限性

僅監測群體耗氧，未解析單細胞異質性。  

 

未結合空間定位（如生物膜內部氧梯度）。  

 

結論

nimA基因的作用：  

 

通過維持PFOR活性和氧耐受性，促進高效耐藥進化，避免鐵限制策略的代謝代價。  

耐藥機制二分法：  

 

無nimA菌株：依賴血紅素轉運下調→鐵限制→鐵依賴酶失活（核心策略）。  

 

含nimA菌株：通過未知機制（非直接降解藥物）實現耐藥，伴隨FprA上調。  

治療意義：  

 

鐵補充可部分逆轉無nimA耐藥株敏感性，為耐藥感染提供潛在輔助策略。  

 

耐藥模型創新點

 

提出電子傳遞鏈重構假說（圖4）：  

nimA可能 redirect電子流，減少甲硝唑還原活化（避免毒性中間體生成），同時維持能量代謝。  

 

注：文檔中所有圖片（圖1-3）和表格（表1-5）均已按原始描述位置嵌入分析。Unisense微電極數據詳見表5及相關方法學描述。