Role of Nitric Oxide in Hydroxylamine Oxidation by Ammonia-Oxidizing Bacteria

一氧化氮在氨氧化細菌羥胺氧化中的作用

來源：Applied and Environmental Microbiology August 2023 Volume 89 Issue 8

 

摘要核心內容

 

本研究通過電化學傳感器和溫和NO清除劑PTIO，探究了NO在模型氨氧化細菌（AOB）Nitrosomonas europaea中的代謝作用。核心發現：

 

PTIO不抑制氨氧化：PTIO能有效清除NO但不影響AOB的氨氧化活性（與強抑制劑ATU/乙炔不同）（圖2, 圖3）。

 

 

NO產生比例：

氧充足條件：NO產量僅為NO??產量的3.15%-6.23%（非游離中間產物）（圖7）。

 

氧限制條件：NO產量高達NO??產量的43.5%-54.4%（游離中間產物）（圖4, 圖7）。

 

N?O生成機制：氧限制下PTIO完全抑制N?O產生，證明NO是反硝化途徑的關鍵中間體（圖4B）。

酶結合假說：正常條件下NO可能與羥胺脫氫酶（HAO）的鐵中心緊密結合，僅在底物飽和或氧限制時釋放（圖5C）。

 

 

研究目的

 

明確NO在氨氧化過程中的角色（游離中間體 vs. 酶結合中間體）。

解析氧條件（充足 vs. 限制）對NO代謝途徑的影響。

驗證PTIO作為NO清除劑在AOB研究中的適用性。

 

研究思路與技術路線

 

graph TD

A[培養條件控制] --> B[氧充足 vs. 氧限制]

B --> C[添加抑制劑/PTIO]

C --> D[實時監測氣體代謝]

D --> E[UV-Vis光譜驗證]

E --> F[代謝機制解析]

 

關鍵實驗設計：

抑制劑對比：ATU（氨單加氧酶抑制劑）、乙炔（不可逆AMO抑制劑）與PTIO（NO清除劑）對氨氧化的即時影響（圖2）。

氧條件調控：搖床轉速（250 rpm = 氧充足；80 rpm = 氧限制）模擬不同環境（圖4, 圖7）。

PTIO作用機制：通過UV-Vis光譜驗證PTIO與NO/NH?OH的反應特異性（圖5）。

氣體實時監測：Unisense微電極同步測量O?、NO、N?O濃度（圖2, 圖4）。

 

關鍵數據及研究意義

數據類別 來源圖表 研究意義

PTIO不抑制氨氧化 圖2, 圖3 證明NO非氨氧化必需游離中間體

氧限制大幅提升NO產量 圖4, 圖7 揭示氧條件調控NO代謝途徑

PTIO完全抑制N?O生成 圖4B 確立NO為反硝化關鍵中間體

PTIO光譜特征變化 圖5A, B 驗證PTIO特異性清除NO（非NH?OH）

NO產量比例定量     圖7 提供NO代謝通量直接證據

 

核心結論

 

NO非游離中間體：正常氧條件下，NO與HAO酶的鐵中心緊密結合，不游離于胞外（PTIO清除不影響氨氧化）。

氧限制觸發NO釋放：缺氧時，AOB通過反硝化途徑產生游離NO，貢獻溫室氣體N?O排放（圖4）。

PTIO為可靠工具：PTIO可特異性清除游離NO，適用于AOB代謝研究（圖5）。

代謝途徑差異：AOB（N. europaea）與AOA（氨氧化古菌）的NO代謝機制不同，PTIO抑制AOA生長但不影響AOB。

 

Unisense電極數據的深度解讀

技術原理

 

傳感器類型：Clark型氧微電極（OX-MR）、NO微電極（ISO-NOP/amiNO-700）、N?O微電極（N?O-MR）。

測量系統：

三端口玻璃反應室（80 mL）集成微電極。

實時數據采集（1 Hz），同步監測O?消耗、NO/N?O生成動力學。

校準：O?電極（空氣飽和/N?校準）；NO電極（酸性KNO?標定）；N?O電極（N?O氣體標定）。

優勢：秒級分辨率、無損監測、多參數同步。

 

關鍵發現與意義

 

PTIO的即時效應（圖2E, F）：

添加PTIO后，NO信號立即消失（<1分鐘），但O?消耗速率不變。

意義：直接證明NO清除不影響氨氧化主途徑，否定NO作為必需游離中間體的假說。

 

氧限制下的氣體動力學（圖4）：

氧限制時，NO濃度升至4-6 μM，N?O持續積累。

添加PTIO后，NO降至檢測限以下，N?O生成完全停止。

意義：首次實時捕獲NO到N?O的代謝偶聯，確立反硝化途徑的限速步驟。

 

代謝抑制劑對比（圖2A-D）：

ATU/乙炔使O?消耗和NO信號同步驟降（秒級響應）。

意義：區別于PTIO，證實AMO酶是氨氧化的核心開關。

 

研究價值

 

推翻舊模型：否定了“NO是羥胺氧化必經游離中間體”的傳統觀點（Caranto et al., 2017）。

環境應用：解釋農業土壤中氧波動如何通過AOB反硝化增加N?O排放（全球變暖潛在機制）。

技術革新：Unisense多電極系統為微生物氣體代謝研究提供高分辨率動態平臺。

 

局限與建議

 

未解析酶機制：需結合蛋白組學驗證HAO結合NO的假說。

單一菌種研究：需拓展至其他AOB（如Nitrospira）和AOA。

建議：聯用13N同位素示蹤，定量NO代謝通量。

 

結論

 

本研究通過Unisense微電極和PTIO清除劑，揭示了NO在AOB中的雙重角色：

 

氧充足時：NO作為酶結合中間體，不游離釋放。

氧限制時：NO成為反硝化途徑的游離中間體，驅動N?O生成。

該成果修正了氨氧化代謝模型，為調控農業N?O排放提供了新靶點。