Hydrogenase-based oxidative biocatalysis without oxygen

基于氫化酶的無氧氧化生物催化

來源：Nature Communications | (2023) 14:2693

 

摘要核心內容

 

本研究提出了一種無氧條件下基于氫化酶（SH）的NAD?再生系統，替代傳統依賴氧氣的NADH氧化酶（NOX）。關鍵突破：

 

反應機制：SH通過氧化NADH生成H?（而非H?O?），實現100%原子效率的NAD?再生（圖1）。

 

性能優勢：在D-木糖→α-酮戊二酸的多酶級聯中，SH的NAD?周轉數（TTN）高達44,000 mol/mol酶，遠超NOX（圖4）。

 

 

技術突破：系統在開放體系中穩定運行，H?作為唯一副產物可實時移除，避免O?依賴的傳質限制（圖5-6）。

 

 

 

應用潛力：SH在攪拌反應器與放大實驗中保持高活性，為工業化無氧生物催化提供新路徑。

 

研究目的

 

開發一種不依賴O?的NAD?再生系統，解決傳統NOX的氧氣傳質瓶頸。

驗證氫化酶（SH）在氧化NADH生成H?過程中的效率與穩定性。

評估SH系統在單步及多酶級聯反應中的實際應用潛力。

 

研究思路

 

graph TD

A[酶系統構建] --> B[性能優化]

B --> C[單步反應驗證：D-木糖→D-木糖酸]

C --> D[多酶級聯驗證：D-木糖→α-酮戊二酸]

D --> E[動力學與放大實驗]

E --> F[與傳統NOX系統對比]

 

關鍵實驗設計：

酶系統：來自Ralstonia eutropha的氫化酶（SH）作為NADH氧化催化劑（圖1）。

優化條件：添加FMN使SH活性提升7倍，NADH氧化活性達0.22 U/mg。

對照系統：FAD依賴型NADH氧化酶（NOX）作為傳統方法對照。

 

關鍵數據及意義

數據類別 來源圖表 研究意義

NADH氧化活性 圖1a FMN提升SH活性7倍，揭示輔因子優化對催化效率的關鍵作用

 

單步反應性能 圖2   SH系統產物生成速率（10 μmol/h）為NOX的4倍，證明無氧系統高效性

 

多酶級聯TTN  圖4, 表1 SH的TTN（10,000–44,000）顯著高于NOX，驗證級聯反應適應性

 

 

H?生成動態  圖5a-b H?產量與產物形成正相關（r=0.93），證實SH催化機制為NADH→H?

放大實驗穩定性 圖6  10 mL規模TTN>8,000，H?累積205 μmol，證明系統可線性放大

核心結論

 

高效NAD?再生：SH系統在無氧條件下實現TTN高達44,000，為NOX的4–10倍（表1）。

技術優勢：

無需O?傳遞：開放體系H?自發逸散，規避NOX的O?溶解與傳質瓶頸（圖4）。

副產物價值：H?可作為清潔能源或還原劑再利用（圖5）。

酶工程突破：SH在E. coli中成功表達，產量達1 L發酵/日（補充表4），解決工業化量產障礙。

應用前景：系統兼容好氧/厭氧環境，適用于O?敏感底物（如萜烯、多酚）的生物催化。

 

Unisense電極數據的深度解讀

技術原理

 

傳感器類型：Unisense H?微電極（NP型）

檢測原理：安培法實時監測液相H?濃度（0–100%飽和度）

校準方法：H?飽和溶液（100%） vs. N?飽和溶液（0%）

 

關鍵發現與意義

 

H?生成動力學（圖5a-b）：

速率：D-木糖氧化中H?生成達1 mmol·L?1·h?1（圖5a）。

相關性：H?濃度與α-酮戊二酸產量線性相關（R2=0.91），證實SH催化NADH氧化→H?的化學計量關系（2H?/產物）。

意義：首次實時量化SH的逆向電子傳遞（NADH→H?），推翻“SH僅催化H?→NADH”的傳統認知。

 

系統開放性驗證（圖5b）：

H?擴散：攪拌后液相H?濃度驟降（>50%），證明開放體系高效移除H?（圖5b）。

意義：為反應平衡向NAD?再生方向移動提供直接證據，解釋TTN提升機制。

 

工藝優化指導：

脈沖實驗：添加D-木糖后H?再生（圖5a），提示底物濃度調控可優化H?產率。

放大設計：10 mL反應器中H?氣相累積（205 μmol）與液相監測數據吻合（圖6），驗證Unisense數據的可靠性。

 

技術價值總結

 

機制解析：實時捕捉SH的雙向催化活性（NADH氧化/H?生成），揭示無氧NAD?再生路徑。

工藝監控：為開放體系設計提供H?擴散動力學參數，指導反應器設計與氣體管理。

跨平臺應用：該電極適用于其他產H?系統（如電催化、光催化），推動綠色生物制造發展。

 

注：Unisense電極在本研究中的不可替代性在于其高時空分辨率與無損監測能力，為酶促反應機理研究提供了不可替代的工具支撐。