結果與討論

自由基淬滅能力評估

在Fenton反應中，由羥基自由基介導的形成在啤酒老化過程中極為重要，導致異味和啤酒質量惡化。該反應由亞鐵離子（Fe2?）催化，將過氧化物還原為羥基自由基。高反應性羥基自由基立即與乙醇（啤酒中含量第二豐富的成分）反應，形成α-羥乙基自由基。

通過加入自旋陷阱PBN實現自由基的量化。α-羥乙基自由基被PBN捕獲或可能與樣品中存在的抗氧化劑反應，生成乙醇和半惰性抗氧化劑自由基。

自旋加合物通過ESR檢測，并用作添加樣品抗氧化或促氧化活性的指標。自旋加合物信號的減少代表抗氧化活性，由于樣品中抗氧化劑對短壽命自由基的清除。另一方面，信號強度的增加代表促氧化效應，由于在Fenton系統中誘導自由基形成。該模型用于評估不同麥芽麥汁樣品（pilsner、melano和black）在模型啤酒（5.8%乙醇）中的抗氧化能力，以評估不同麥芽對啤酒氧化穩定性的影響。

通過ESR評估添加不同麥芽麥汁對自旋加合物水平的影響。獲得的ESR光譜由超精細耦合常數a_N=16.0 G和a_H=3.3 G的三重雙峰組成，這與PBN自旋加合物的α-羥乙基自由基一致。自旋加合物的量化通過測量第二雙峰的強度進行。

所有類型的麥汁樣品在測試濃度范圍（0至5%v/v）內均降低了自旋加合物水平，表明所有麥芽類型均能在鐵催化Fenton反應中清除自由基，顯示出整體抗氧化能力。在Fenton assay中直接添加pilsner和melano麥汁（5%麥汁）導致自旋加合物水平比對照減少約70%。黑麥芽麥汁也使自旋加合物形成減少約40%；然而，抗氧化效應比pilsner和melano麥芽低約50%。如先前報道，抗氧化能力被發現與麥芽樣品的顏色和烘烤程度相關，而在Fenton assay中，烘烤麥芽似乎比淺色麥芽具有更顯著的促氧化性質。

對于較低麥汁含量（<0.75%），melano麥芽的ESR信號低于pilsner和黑麥芽，表明melano麥芽類型在較低濃度下更有效地清除自由基。對于麥汁含量高于0.75%，melano和pilsner麥芽的ESR信號強度相似，表明兩種麥芽的抗氧化能力非常相似。另一方面，黑麥芽在麥汁含量高于0.75%時給出最低的抗氧化能力（較高的自旋加合物水平），而自旋加合物的最小含量在約4.0%麥汁時獲得。如圖所示，黑麥芽麥汁含量高于2%時，自旋加合物的數量略有增加，與由于主導的自由基形成誘導而產生的整體促氧化效應一致。

促氧化效應分析

黑麥芽在基于Fenton的模型啤酒系統中顯示出比淺色和melano麥芽更低的自由基淬滅能力，通過自旋捕獲和ESR檢測確定。為了研究黑麥芽誘導的可能促氧化效應，將不同麥芽麥汁在缺乏H?O?和/或催化劑（Fe2?）的情況下添加到Fenton assay中。在缺乏Fe2?的條件下（僅存在H?O?而無反應物），對照和麥芽麥汁樣品之間在自旋加合物形成中未觀察到顯著差異。然而，在存在Fe2?的情況下，黑麥芽導致自旋加合物比對照增加近三倍。這些結果確定了黑麥芽在存在Fe2?和大氣O?的情況下的整體促氧化效應，通過Fenton反應加劇自由基形成。氧氣可能與混合物中存在的Fe2?反應生成過氧化氫并觸發Fenton反應形成自由基，這可以解釋存在Fe2?時ESR信號的較高強度。

這些結果表明，黑麥芽中存在的化合物能夠淬滅自由基，但也能通過涉及還原Fe3?為Fe2?的機制誘導羥基自由基形成，可用于新的氧化過程。這與先前研究一致，其中烘烤麥芽能夠在Fenton系統中誘導促氧化效應，由于其還原性質，導致鐵還原并生成羥基自由基。深色麥芽的優異還原能力可歸因于烘烤過程中的Maillard反應和MRPs形成。

高分子量化合物分離

黑麥芽誘導自由基形成可歸因于烘烤過程和Maillard反應期間高分子量化合物的形成。因此，通過SEC對不同麥芽類型生產的麥汁進行分級，以表征烘烤過程中形成的化合物。所有麥芽麥汁主要特征為分子量在6×102至5×103g/mol之間的低分子量化合物。僅在黑麥芽中發現高分子量化合物的額外區域（表示為圖4a中的F1至F6餾分），分子量大于10?g/mol且呈深棕色，如表1所述（介于0.25±0.02 for F1和59.0±0.1 for F3之間）。由于這些化合物已被確定為深色麥芽可能促氧化效應的貢獻者，此處從黑麥芽麥汁中分離出HMW餾分，并進一步分析以評估其對Fenton assay的影響。

圖4 a 黑麥芽麥汁樣品（檢測波長280 nm）的尺寸排阻色譜圖（Superdex 30色譜柱）。色譜圖中識別的組分（F1至F6）代表黑麥芽中識別到的高分子量褐變化合物。b 洗脫出的黑麥芽麥汁峰濃度與通過光散射獲得的摩爾質量的疊加圖。c 通過排列面板B中所示數據得出的樣品分子質量分布示意圖。黑麥芽麥汁樣品（1:5稀釋）以0.5 mL/min的流速在串聯的Superose 6和Superdex 200色譜柱上進行分離。

尺寸測定通過光散射

通過結合SEC與靜態光散射進一步檢查黑麥芽中化合物的尺寸。洗脫深色麥芽麥汁的色譜圖及通過光散射獲得的摩爾質量如圖4b所示。高分子量化合物的分子質量測定在4×10?至10?g/mol范圍內。獲得的結果顯示黑麥芽麥汁包含兩組化合物，一組高分子量化合物（平均10?g/mol）和一組低分子量（平均10?g/mol），后者也在pilsner和melano麥汁中發現。這些化合物是復雜聚合反應的產物，導致高分子量褐變化合物。Jehle等人也證明了黑啤酒和黑麥芽中存在水溶性穩定自由基，稱為MLD衍生自由基，分子量約10?-10?g/mol。

這與先前結果一致，表明淺色麥芽特征為分子量小于103g/mol的LMW化合物，而烘烤麥芽特征為深棕色且分子量高于3×10?g/mol的HMW化合物。

高分子量化合物對自由基形成的影響

從黑麥芽中分離出的含有HMW化合物的餾分隨后通過ESR在Fenton assay中分析，以評估這些化合物的抗氧化能力及其對麥芽整體抗氧化能力的影響。

如圖所示，從黑麥芽中分離的HMW餾分（圖4A中的F1至F6）在Fenton assay中導致自由基顯著生成。具有深棕色的F3餾分負責自由基增加約40%。這些結果與促氧化效應一致，因為自由基含量高于對照，表明這些HMW化合物通過涉及鐵還原的機制在Fenton反應中誘導自由基形成。先前報道黑麥芽在Fenton系統中負責較低的羥基自由基清除，與涉及鐵還原及隨后羥基自由基增加的機制一致。在特殊麥芽的麥汁和啤酒基質中可觀察到非常活潑自由基的更強生成，由于Fe3?快速還原為Fe2?。分離的HMW化合物應類似于Maillard反應期間形成的還原酮，因為兩者在Fenton反應中均表現出促氧化活性，還原鐵導致過氧化物氧化和活潑自由基形成。然而，Morales提出HMW化合物不能將Fe3?還原為Fe2?。我們的結果表明，盡管黑麥芽能夠減少Fenton反應產生的自由基水平，但從黑麥芽中分離的HMW化合物能夠誘導自由基形成，導致烘烤麥芽麥汁的整體抗氧化能力降低。Noddekar和Andersen證明焦糖化產物在存在過氧化物的情況下由于Fe3?還原為Fe2?而生成自由基。Cortes等人也證明高溫殺青的深色麥芽導致自由基含量更高和麥汁及啤酒的氧化穩定性更低。

氧氣攝取實驗

通過監測溶液中O?水平評估HMW化合物在氧化過程中的參與及其在典型啤酒系統中觸發氧化反應和隨后自由基形成的能力。為此，將不同麥芽類型獲得的麥汁以及從黑麥芽中分離的HMW餾分添加到水性乙醇溶液（5.8%,v/v）中，其中含有Fe2?，并在規定時間內監測O?水平。O?可在乙醇氧化的Fenton階段被消耗，從氫過氧自由基產生過氧化氫。

presented的結果顯示，黑麥芽負責最高的氧氣水平攝取（12.2%），而pilsner和melano麥芽麥汁負責氧氣水平攝取分別為6.9和10.2。這與通過ESR評估的黑麥芽麥汁較低的自由基清除能力一致，并與涉及Fenton反應的氧化反應增加兼容。F3餾分負責溶解氧減少10.5%，這與ESR獲得的結果一致，并且由于涉及Fe3?還原為Fe2?的機制導致自由基水平增加。

MRPs的強還原性質已被報道導致在麥汁和最終啤酒中觀察到的氧物種非常活潑自由基的生成。總之，結果證明鐵在HMW褐變化合物的促氧化效應中至關重要，導致氧氣攝取加速，從而在麥汁中產生更高的自由基生成。已顯示溶解氧量在黑麥芽和從黑麥芽中分離的HMW餾分存在下明顯減少，與ESR在存在Fe2?時測定的Fenton assay中較高水平的自由基兼容。

表2麥芽麥汁（pilsner、melano和black）和從黑麥芽中分離的HMW餾分在存在Fe2?（110μM）初始添加到水性乙醇溶液（5.8%,v/v）中的氧氣攝取樣品O?攝取（%）

結論

通過芬頓系統評估了烘烤對麥芽整體促氧化和抗氧化能力的影響，并研究了烘烤過程中產生的 MLD 對麥芽促氧化效應的機制。在基于芬頓的模型啤酒系統中，通過自旋捕獲和ESR檢測確定，黑麥芽的自由基淬滅能力低于皮爾森麥芽和黑麥芽。不同麥芽類型中觀察到的自由基淬滅能力差異與烘烤程度及 HMW 褐變化合物的形成有關。這些化合物通過鐵還原及隨后自由基的生成機制，在芬頓系統中表現出增加自由基形成的能力。事實上，黑麥芽及其分離的 HMW 化合物能夠通過增加O2吸收加速啤酒模型中的金屬催化氧化，這與ESR測定的芬頓試驗中較高水平的自由基相一致，這些自由基由 HMW 化合物通過還原氧化金屬離子如Fe3+生成。