材料與方法

化學品和材料

Pilsner（EBC 3-5）、melano（EBC 60-80）和black（EBC 1300-1500）大麥麥芽從Maltbazaren（Rodovre,Denmark）獲得。絕對乙醇、2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基（TEMPO）、N-叔丁基-α-苯基硝酮（PBN）、L-抗壞血酸（鈉鹽）和三水合乙酸鈉從Sigma（Steinheim,Germany）購買。過氧化氫（30%）、七水合硫酸亞鐵、氫氧化鈉顆粒和冰乙酸從Merck（Darmstadt,Germany）購買。氯化鈉從Riedl-de Haen（Seelze,Germany）獲得。所有化學品均為分析級或最高純度。水通過Milli-Q水純化系統（Millipore,Billerica,USA）純化。

糖化

使用LG-automatic MA-001全自動糖化器（Lg-automatic aps,Frederiksvark,Denmark）進行EBC congress糖化，并有所修改。五十克（±1 g）粉碎麥芽在200 mL去離子水中于46°C糖化30分鐘，然后以每分鐘1°C的速度升溫至70°C。接著，加入100 mL 70°C的去離子水。在70°C保持60分鐘（糖化休息）。此后，糖化醪冷卻至室溫，收集麥汁樣品。加入去離子水調整體積（最終體積300 mL），隨后通過開放式折疊濾紙（MN 614 Macherey-Nagel filters,Düren,Germany）過濾。樣品在過濾后直接分析或冷凍在-18°C直至分析。

通過尺寸排阻色譜分離麥汁組分

麥汁樣品通過0.2μm Minisart注射器過濾器（Sartorius Stedim,G?ttingen,Germany）過濾，并通過尺寸排阻色譜（SEC）使用?KTA FPLC系統（Pharmacia LKB Biotechnology AB,Uppsala,Sweden）進行分離，系統裝有填充Superdex?30 prep grade凝膠過濾樹脂的色譜柱（2.6×61 cm；Amersham Biosciences,Hiller?d,Denmark）。注入2 mL麥汁，用0.1 M乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）以2.5 mL/min的流速洗脫。流出液在280 nm監測。使用自動餾分收集器（FRAC-900,Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden）收集10 mL餾分，并根據洗脫曲線合并。此后，餾分在室溫下使用miVac模塊化離心真空濃縮器（Genevac Ltd,Suffolk,UK）濃縮20倍，并冷凍在-18°C直至分析。使用六種不同分子量標準品（牛血清白蛋白、細胞色素C、核糖核酸酶A、胰島素、（H-半胱氨酸-酪氨酸-OH）2和L-色氨酸；各約0.25 mg/mL）的洗脫時間制作校準曲線，并確定每個餾分中分離化合物的尺寸范圍。

顏色測定

根據Analytica EBC，使用Varian Cary 3紫外-可見分光光度計（EUA）進行比色測定：

C=25·f·A???

其中C為EBC單位顏色，f為稀釋因子，A???為430 nm處的吸光度，25為乘法因子。通過SEC分離的餾分的顏色使用TECAN GENios Plus微孔板讀數器（Tecan Group Ltd,M?nnedorf,Switzerland）在96孔板中測量。

通過靜態光散射結合尺寸排阻色譜進行尺寸測定

設置包括LC10AD HPLC泵（Shimadzu,Kyoto,Japan），將樣品依次通過Superose 6和Superdex 200色譜柱（GE Healthcare），然后通過Dawn EOS多角度光散射儀器（Wyatt Technology,Santa Barbara,CA,USA）帶有K5流動池，最后通過RID10A差示折射計（Shimadzu,Kyoto,Japan）。光散射儀器通過運行BSA（100μL,5 mg/mL）使用pH 7.0磷酸鹽緩沖液含60 mM NaCl作為洗脫液，通過軟件Astra 4.73.04校準。BSA單體峰指定分子質量為66,400 g/mol和折射率增量dn/dc=0.185 mL/g。

用于麥汁樣品測量的洗脫液為0.1 M乙酸鈉緩沖液，pH 5.0，含60 mM NaCl。樣品通過0.22μm Millex GV注射器過濾器（Millipore）過濾，并在洗脫液中稀釋如下：pilsner麥汁1:2，melano麥汁不稀釋，黑麥汁1:5。將100μL樣品加載到色譜柱上，以0.5 mL/min洗脫。使用Astra軟件計算洗脫曲線每點對應的分子質量（和回轉半徑），假設洗脫物種的折射率增量為dn/dc=0.145，典型于多糖。

基于Fenton反應的自旋加合物電子自旋共振檢測

自旋加合物的電子自旋共振（ESR）檢測根據R?djer等人描述的assay進行，并有所修改。將PBN（3.7 mL,31 mM）在水性乙醇溶液（5.8%,v/v）中與20μL FeSO?（22 mM）和200μL待分析樣品混合。作為參考，加入200μL Milli-Q水代替樣品。通過加入80μL H?O?（24 mM）啟動反應。H?O?的濃度通過分光光度法確認（ε???=39.4 M?1cm?1）。混合物輕輕混合，在室溫下孵育2分鐘，并轉移至50μL ESR石英毛細管微量移液器（Blau-brand IntraMARK,Brand GmbH,Wertheim,Germany）。加載的微量移液器在一端密封并放置在ESR腔中。ESR光譜在JEOL JES-FR30 ESR光譜儀（JEOL Ltd,Tokyo,Japan）上記錄，使用以下儀器設置：4分鐘掃描時間、4 mW微波功率和0.1 mT調制幅度。光譜的幅度測量為中心雙峰的高度，相對于附著在ESR腔上的內部Mn2?標準品的ESR信號高度。每天記錄水性TEMPO溶液的ESR光譜以消除日間變異。

溶解氧測量

氧氣含量在2 mL水性乙醇溶液（5.8%,v/v）與20μL FeSO?（11 mM）和100μL待分析樣品的混合物中測定，按此順序加入。作為參考，加入100μL Milli-Q水代替樣品?；旌衔镌? mL微呼吸室（Unisense）中輕輕混合，浸入25°C水浴中，并通過腔蓋中的薄毛細管使用Clark型電流氧微傳感器連接PA2000皮安計儀器（Unisense,Aarhus,Denmark）在90分鐘內測量氧氣含量。裝置校準通過使用空氣O?飽和的水性乙醇溶液（1 M）作為100%O?含量和0.1 M L-抗壞血酸溶液在0.1 M NaOH中作為0%溶解氧進行，使用以下儀器設置：2000 pA范圍和-0.80 V極化。

統計分析

結果表示為至少三次獨立實驗的平均值±標準差（SD）。使用GraphPad Prism軟件v.5.01（GraphPad Software,La Jolla,California,USA）進行單因素ANOVA和Tukey檢驗檢測均值差異。在一些統計分析中考慮了的方差齊性要求。p值小于0.05（p<0.05）被認為表示統計學顯著差異。