2.4.電生理記錄與分析


基本的MEA記錄方案和記錄溶液如前所述。Hippo-MEA的數據使用MEA2100-Mini-system記錄。使用EP2 Ag/AgCl顆粒作為參考電極。實驗在持續灌注記錄溶液（3 ml/min，32-34°C，溶液用95%O?/5%CO?氣體充氧）的條件下進行，切片用HSG-MEA-5AD錨定器固定。記錄前讓切片在MEA上穩定30分鐘。實際記錄包括10分鐘基線期、10分鐘4-氨基吡啶（4-AP；1 mM）處理期和10分鐘沖洗期。


細胞外動作電位（EAP）和局部場電位（LFP）數據的分析基于先前描述的NeuroExplorer流程。簡而言之，EAPs從帶通濾波信號（300-3000 Hz，二階巴特沃斯濾波器）中檢測，當其振幅超過噪聲標準偏差（SD）的-5.5倍時被判定為EAP。在4-AP峰值效應期間（970秒至1270秒）的任何10秒區間內達到活性電極標準（最少兩個EAPs，平均頻率0.05 Hz，瞬時頻率0.1 Hz）的電極被認為顯示出真實的EAP活動。LFP數據從低通濾波信號（<200 Hz，二階巴特沃斯濾波器）中提取，分析五個頻帶：delta（δ）1-3 Hz，theta（θ）4-8 Hz，alpha（α）9-13 Hz，beta（β）14-30 Hz和gamma（γ）30-100 Hz。使用閾值法識別對LFP數據每個頻率范圍有反應的電極。計算每個電極和頻率范圍在基線期（0秒至600秒）的功率譜密度（PSD）平均值，以此確定基線噪聲。如果在4-AP期間（670秒至1270秒）的任何10秒區間的PSD超過基線噪聲SD的5.5倍，則該電極被視為有反應。


2.5.免疫組織化學


為確保染色用的冰凍切片完整，冠狀免疫組織化學（IHC）切片厚度為990μm，病例1除外（僅有300μm切片）。IHC切片與Hippo-MEA切片在組織中的頭尾距離為：病例1相距300μm，病例2相距1500μm，病例3相距0μm。樣本經過固定、冷凍保護、冷凍切片成20μm厚切片，并用先前描述的方法染色。使用的一抗包括：用于神經元可視化的NeuN（1:200稀釋）和用于星形膠質細胞染色的GFAP（1:750稀釋）。使用Alexa Fluor 488（1:300稀釋）和Alexa Fluor 568（1:300稀釋）作為二抗。圖像使用Leica Thunder Imager 3D組織切片掃描儀獲取。


3.結果與討論


3.1.Hippo-MEA的特性


Hippo-MEA中電極的阻抗為35±5 kΩ（平均值±SD），低于先前用相同方法制備的電極所報告的值（83±5 kΩ）。雖然較低的阻抗通常是更好信號檢測的標志，但此處測量的值是由于更大的電極直徑（60μm對30μm）。在基線記錄期間，RMS噪聲為3.4±0.5μV（圖1E），這與先前用相同方法制備的電極相似。安裝工具使得樣品杯和Hippo-MEA的組裝變得容易（圖1A-D）。硅膠器件附著到玻璃狀MEA表面可能需要例如等離子體處理，但在此超過10個月的時間內未觀察到粘合問題。


3.2.Hippo-MEA上的EAP活性與病理結構特征


用Hippo-MEA分析的樣本對4-AP處理表現出不同的EAP活性（圖1F-K）。病例1有4/59個活性電極（檢測到EAPs的電極；圖1F），病例2有1/59（圖1G），病例3有4/59（圖1H）。在峰值藥物效應期間（970秒至1270秒），活性電極的平均放電頻率在病例1為0.046 Hz，病例2為0.010 Hz，病例3為0.067 Hz。在單個電極中，放電頻率可瞬間高達3.333 Hz（圖1H）。

活性電極的定位（圖1 I-K）與錐體細胞層（圖1 L-N）不符，這與觀察到的錐體細胞層中NeuN陽性細胞（神經元）的丟失以及病理學家對海馬硬化的評估一致（表1，組織病理學）。相反，活性電極的位置更對應于齒狀回的顆粒細胞層，那里有明顯的NeuN陽性神經元（圖1I對L，J對M和K對N）。除了硬化，海馬膠質細胞增生是TLE的典型病理特征。所有三個海馬體中對星形膠質細胞蛋白GFAP的染色均顯示出廣泛的膠質增生（圖1L-N），這可能導致切片大部分區域未顯示EAPs（圖1I-K）。活性水平也可能受到長時間恢復期的影響（見樣本運輸與制備）。總體而言，結果表明Hippo-MEA能夠識別活性和非活性區域，并能從硬化的人類海馬體切片中檢測到EAPs。


3.3.Hippo-MEA上的LFPs

與EAP活性類似，Hippo-MEA上的LFP活性在患者之間也存在差異。代表性的LFP軌跡顯示在圖2A和B（包含患者3的EAP點陣圖）。響應電極數量最多的頻帶是delta頻帶（平均9/59），而響應電極數量最少的頻帶是alpha頻帶（平均2/59）（圖2C）。對gamma頻帶響應的電極數量是可變的（從2/59到11/59）。腦電圖數據中delta頻帶功率的增加是TLE患者癲癇活動的一個標志。因此，有趣的是，4-AP（一種已知的驚厥劑）尤其增加了delta頻帶功率，即使在病例2中也是如此，而病例2在其他方面比其他病例活性低。

隨時間變化的歸一化LFP頻帶功率顯示在圖2D-R（左側），同一子圖中顯示了4-AP處理期間整個切片的平均頻帶功率增加（右側）。同樣，對4-AP刺激反應最強烈的電極并非位于錐體細胞層附近，這一特征可能與錐體神經元的硬化有關（圖2D-R對比圖1L-N；表1）。相反，顯示4-AP誘導LFP活性增加的電極更靠近齒狀回的顆粒細胞層。結果表明，Hippo-MEA能夠檢測硬化人類海馬體切片中的LFP活性，并能區分樣本中的活性和非活性位點。


4.結論


Hippo-MEA和樣品杯的尺寸適合記錄大樣本（如海馬體切片）。Hippo-MEA能夠同時記錄來自海馬體不同亞區的EAP和LFP數據。雖然該記錄系統只允許59個記錄電極，限制了陣列的空間分辨率，但該記錄系統是商業化的，并且允許使用現有的軟件，使得Hippo-MEA易于被采用。通過與其他方法的數據進行比較，Hippo-MEA可以為改進TLE手術中最佳切除區域的識別提供一個起點，并有助于理解海馬體病理對TLE的貢獻。