盆栽實驗

進行盆栽實驗以評估CAW對生長中蘋果樹根區土壤氮轉化微生物和氮氧化物的影響。實驗設計包括五個處理，將均質的CAW以以下比例施用于土壤：0（C0，對照）、5（C5）、10（C10）、20（C20）和40（C40）g kg?1。花盆（30cm x 25cm，每盆含10kg土壤）采用隨機完全區組設計排列，每個處理三個重復。

根據當地建議，施用兔糞固體，比例為5.8 g kg?1土壤，相當于100 mg總氮kg?1土壤。根據當地澆水方法，將土壤濕度調節至20%重量含水量，為植物生長提供適宜條件，這五個處理分別相當于約64.01%、61.21%、58.53%、54.25%和48.00%的充水孔隙度（WFPS）。使用濕度計（TOP Instrument，中國浙江）定期檢查土壤含水量，并通過添加去離子水維持初始WFPS。

每個盆栽種一棵兩年生富士蘋果樹（Malus domestica Borkh，砧木為Malus hupehensis Rehd）。處理120天后（2014年8月），從每個處理的花盆中取三個土壤芯（直徑2厘米，深20厘米），放入無菌塑料袋中，密封并在冰上運輸至實驗室。在那里將它們混合形成一個均質樣品，并通過2毫米篩網過篩。一部分樣品用于分析物理和化學性質，另一部分用于DNA提取和土壤微生物分析。

土壤微生物總DNA提取、PCR和定量PCR（qPCR）

使用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit（Omega Bio-tek Inc.,Norcross,GA,USA）根據制造商說明從0.25 g土壤樣品中提取土壤微生物總DNA。使用NanoDropTM2000分光光度計（Thermo Scientific,Waltham,MA,USA）測量DNA濃度。

氮轉化功能基因的聚合酶鏈反應（PCR）按以下步驟進行：95°C 5分鐘，然后進行40個循環：94°C 45秒，55°C 45秒，72°C 1分鐘，最后72°C 10分鐘。使用的引物列于文件S1（支持信息）中的表S1。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上驗證并純化。

純化的PCR產物亞克隆到PMD18-T simple載體（TaKaRa,Dalian,China）中，從每個樣品中隨機選擇陽性克隆進行測序（BGI,Beijing,China）。回收的序列在NCBI數據庫中進行BLAST搜索。所有驗證的序列使用DNAMAN程序（Lynnon Biosoft,Pointe-Claire,Quebec,Canada）進行比對。隨后，提取標準質粒DNA，并使用實時PCR檢測系統（LightCycler®480 Cycler,Roche,Mannheim,Germany）進行熱循環和數據分析，以估算厭氧氨氧化、AOA和AOB amoA、nirS和nirK基因的豐度（更多細節見文件S1及其中的表S2和S3）。

化學分析

微生物生物量碳（MBC）、微生物生物量氮（MBN）和微生物生物量磷（MBP）通過氯仿熏蒸提取法估算。

硝酸還原酶（NR）和亞硝酸還原酶（NiR）活性根據方法測定（見文件S1）。土壤氮形態如NO??-N、NO??-N和NH??-N分別采用酚二磺酸分光光度法、重氮偶合反應和靛酚藍比色法測量。

土壤NO和N?O測量

土壤原位NO和N?O濃度使用實驗室微電極研究系統（NO-500和N?O-N,Unisense,Aarhus,Demark）測定。重復校準確保儀器正常工作。每2小時測量每個點，直到NO和N?O濃度信號穩定。

統計分析

在統計分析之前，使用Kolmogorov-Smirnov檢驗評估方差分析（ANOVA）殘差的正態性，并使用Levene檢驗評估方差的同質性。不需要對數據進行轉換。

使用單因素方差分析（one-way ANOVA）和最小顯著性差異法（LSD）確定處理間的顯著差異。除非另有說明，所有注明的顯著差異均在P<0.05水平。

使用Pearson相關系數研究土壤化學變量與功能基因豐度之間的關系（分別以P<0.01和P<0.05為顯著性水平）。使用SPSS 19.0軟件（IBM SPSS Inc.,Chicago,IL,USA）進行統計分析。

為了確定主要土壤特性與物種因子之間的相關性，使用Canoco v4.5（Microcomputer Power,Ithaca,NY,USA）進行冗余分析（RDA）。因為物種變量的去趨勢對應分析（DCA）顯示第一軸梯度長度較短（<3），所以進行線性RDA。在DCA和RDA之前，對物種值進行平方根變換，并對環境變量進行z-score標準化。通過499次無限制蒙特卡洛排列檢驗（P<0.05）評估典型軸的顯著性。

RDA的結果總結在向量和得分在前兩個冗余軸平面上的圖中。在這些圖中，箭頭的相對長度和位置顯示了所選因變量對土壤特性的響應程度和方向。所有圖表均使用Origin 8.5軟件（OriginLab Inc.,Northampton,MA,USA）創建。