胚胎選擇、評(píng)估和加載程序  

在每個(gè)實(shí)驗(yàn)日，隨機(jī)選擇五個(gè)八細(xì)胞階段（第3天）或囊胚階段（第7天）的胚胎，以代表所有形態(tài)質(zhì)量，并 individually 轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有培養(yǎng)培養(yǎng)基的四孔培養(yǎng)皿的一個(gè)孔中。  

第3天胚胎基于細(xì)胞數(shù)（優(yōu)選八個(gè)可見(jiàn)細(xì)胞）、細(xì)胞大小均勻性、健康形態(tài)外觀(guān)和無(wú)碎片進(jìn)行選擇。

第7天胚胎分類(lèi)為早期、完整、擴(kuò)張、孵化或已孵化囊胚。囊胚進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)估，并根據(jù)國(guó)際胚胎移植學(xué)會(huì)（IETS 1998）給出的定義給予質(zhì)量評(píng)分（質(zhì)量1、2、3或4）。此外，每個(gè)囊胚的直徑在立體顯微鏡（SMZ800；Nikon, 日本東京）下使用目鏡測(cè)微尺測(cè)量。  

每個(gè)胚胎的數(shù)字圖像使用數(shù)碼靜態(tài)相機(jī)（GC-X3E；JVC, 日本橫濱）獲取，相機(jī)安裝在倒置光學(xué)顯微鏡（TDM；Nikon）上，帶有熱控制顯微鏡臺(tái)（CO 102；Linkam Scientific Instruments Ltd, 英國(guó)泰德沃思薩里）。  

在加載胚胎前，無(wú)菌玫瑰座放在含有5ml預(yù)平衡培養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（Nunclon dishes；Nunc）中。玫瑰座的每個(gè)毛細(xì)管手動(dòng)填充1.1μl準(zhǔn)備的孵化培養(yǎng)基，并去除任何氣泡。  

使用從2.5ml巴斯德吸管（BIE01141；Ar-Glas, Schott Glaswerke, 德國(guó)美因茨）拉出的薄玻璃毛細(xì)管，每個(gè)選定的胚胎從四孔培養(yǎng)皿中收集，并加載到玫瑰座每個(gè)玻璃毛細(xì)管的底部。玫瑰座中一個(gè)玻璃毛細(xì)管留空，作為無(wú)呼吸活動(dòng)的參考測(cè)量。

隨后，玫瑰座用一對(duì)無(wú)菌鑷子放入玫瑰座盤(pán)支架中。升降臺(tái)抬起，直到玫瑰座盤(pán)支架浸入燒杯中的培養(yǎng)基中。最后，通過(guò)將塑料蓋放在燒杯上獲得半封閉系統(tǒng)。系統(tǒng)靜置，直到在玫瑰座玻璃毛細(xì)管內(nèi)建立穩(wěn)態(tài)線(xiàn)性氧氣梯度。  

氧氣消耗測(cè)量  

超微呼吸系統(tǒng)中使用的測(cè)量原理基于測(cè)量由胚胎在玫瑰座玻璃毛細(xì)管中呼吸產(chǎn)生的線(xiàn)性穩(wěn)態(tài)氧氣梯度。玻璃毛細(xì)管的小內(nèi)部尺寸和培養(yǎng)基的粘度建立了一個(gè)擴(kuò)散控制系統(tǒng)，無(wú)湍流、層流或其他培養(yǎng)基的整體運(yùn)動(dòng)。當(dāng)耗氧胚胎放在毛細(xì)管底部時(shí)，擴(kuò)散空間的圓柱形狀導(dǎo)致系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí) largely 線(xiàn)性濃度梯度。使用文獻(xiàn)中報(bào)告的氧氣呼吸值和毛細(xì)管尺寸，可以計(jì)算典型胚胎在毛細(xì)管底部應(yīng)根據(jù)菲克第一擴(kuò)散定律將氧氣濃度降低約25-50%。這些預(yù)測(cè)隨后通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)量玻璃毛細(xì)管內(nèi)胚胎附近的氧氣濃度驗(yàn)證。

根據(jù)Crank，當(dāng)Dt/l2 = 0.45時(shí)，應(yīng)在時(shí)間t在毛細(xì)管中建立穩(wěn)態(tài)濃度梯度，其中l(wèi)是毛細(xì)管長(zhǎng)度，D是氧氣的分子擴(kuò)散系數(shù)。使用我們測(cè)量系統(tǒng)的適當(dāng)值，我們估計(jì)生成穩(wěn)態(tài)梯度的時(shí)間約為22分鐘，假設(shè)周?chē)到y(tǒng)處于平衡狀態(tài)且不受放置胚胎在管中的干擾。為確保測(cè)量前系統(tǒng)穩(wěn)定，我們決定將所需孵化時(shí)間增加三倍。  

大約1小時(shí)后，通過(guò)測(cè)量毛細(xì)管中連續(xù)等距測(cè)量點(diǎn)的氧氣濃度確定由胚胎呼吸產(chǎn)生的氧氣濃度梯度（圖2A）。記錄通過(guò)將微傳感器尖端向下移動(dòng)通過(guò)充滿(mǎn)培養(yǎng)基的玻璃毛細(xì)管進(jìn)行，以200μm步長(zhǎng)測(cè)量深度達(dá)2500μm的信號(hào)（圖3）。對(duì)于每一步，傳感器信號(hào)由100個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的平均值組成，在2秒平衡后1秒內(nèi)記錄。為了獲取下一個(gè)胚胎的氧氣濃度剖面，玫瑰座盤(pán)用手動(dòng)和輕柔地旋轉(zhuǎn)，使用無(wú)菌吸管將下一個(gè)毛細(xì)管定位進(jìn)行分析。在每輪測(cè)量中，所有五個(gè)胚胎加上空毛細(xì)管都被測(cè)量。作為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行兩輪測(cè)量，從而兩次測(cè)定每個(gè)胚胎的呼吸速率。  

基于氧氣濃度剖面計(jì)算呼吸速率 

估計(jì)呼吸速率的基礎(chǔ)是當(dāng)將呼吸胚胎放在管底部時(shí)，在管長(zhǎng)度上建立顯著的氧分壓降低。由于毛細(xì)管尺寸已知，傳感器測(cè)量的線(xiàn)性氧氣梯度可用于通過(guò)應(yīng)用菲克第一擴(kuò)散定律估計(jì)向胚胎的氧氣通量：  

其中dC/dx是梯度的斜率，從最后十步的記錄中獲得（圖3），D是培養(yǎng)基的擴(kuò)散系數(shù)。在穩(wěn)態(tài)條件下，氧氣通量將等于毛細(xì)管中胚胎的呼吸速率。

培養(yǎng)基中氧氣的溶解度（約9%鹽度和37.0°C）計(jì)算為200μmol/l。38.5°C時(shí)培養(yǎng)培養(yǎng)基中的擴(kuò)散系數(shù)同樣計(jì)算為3.37×10?? cm2/s。單個(gè)胚胎呼吸速率以nl O?/胚胎每小時(shí)（nl/h）表示。  

測(cè)量后處理胚胎和胚胎裂解  

測(cè)量后，玫瑰座用鑷子從玫瑰座盤(pán)支架中取出，放回含有培養(yǎng)基的40mm培養(yǎng)皿中。胚胎 individually 從玫瑰座轉(zhuǎn)移到含有培養(yǎng)培養(yǎng)基的四孔培養(yǎng)皿的一個(gè)孔中。隨后，單個(gè)胚胎轉(zhuǎn)移到含有500μl無(wú)Ca2?和無(wú)Mg2?磷酸鹽緩沖鹽水（Biowhittaker, 美國(guó)馬里蘭州沃克斯維爾）的四孔培養(yǎng)皿中，補(bǔ)充有4 mg/ml聚乙烯吡咯烷酮，使用玻璃吸管洗滌四次，并在立體顯微鏡下檢查以確保無(wú)卵丘細(xì)胞存在。此后，每個(gè)胚胎在立體顯微鏡下轉(zhuǎn)移到0.5ml反應(yīng)管中，含有dNTPs（Finnzymes, 芬蘭埃斯波）、MgCl?（Finnzymes）和0.1 mg/ml蛋白酶K（Boehringer Mannheim, 德國(guó)曼海姆）在10μl PCR緩沖液（DyNazyme緩沖液；Finnzymes）中。含有胚胎的混合物覆蓋有25μl無(wú)DNA酶礦物油。樣品隨后在37°C孵化30分鐘以從胚胎細(xì)胞釋放DNA，然后蛋白酶K在98°C熱滅活8分鐘。最后，樣品存儲(chǔ)在4°C直到進(jìn)行性別診斷。  

通過(guò)PCR進(jìn)行胚胎性別鑒定  

胚胎的性別通過(guò)PCR診斷，基于Y染色體ZFY基因及其X染色體同源物ZFX的存在或缺失，裂解胚胎樣品放入PCR機(jī)中，溫度升高到初始變性步驟（94°C 3分鐘），在此期間向每個(gè)樣品中加入15μl PCR緩沖液中的引物和聚合酶。最終25μl反應(yīng)混合物由10 mM Tris-HCl（pH 8.8在25°C）、50 mM KCl、1.5 mM MgCl?、0.1% Triton X-100、0.2 mM dNTPs、1.5 IU DyNazyme DNA聚合酶（Finnzymes）和10 pmol兩種引物組成。初始變性步驟后，樣品擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)如下：94°C 45秒、54°C 35秒和72°C 15-45秒。最后，樣品在72°C孵化5分鐘。

擴(kuò)增后，每個(gè)PCR產(chǎn)物的10μl用5IU Pstl（Roche Diagnostics GmbH, 德國(guó)曼海姆）在37°C消化1小時(shí)。消化的PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠（MetaPhor；FMC Bioproducts, 美國(guó)羅克蘭）上分離，在1x Tris-硼酸-EDTA緩沖液中染色，含0.5μg/ml溴化乙錠。產(chǎn)生的片段在紫外燈下可視化。在牛中，Pstl將ZFY同源物切割成兩個(gè)片段（344和103 bp），而ZFX同源物的PCR產(chǎn)物（445 bp）保持完整。因此，雄性樣品從三個(gè)片段（445、344和103 bp）的存在識(shí)別，雌性從僅一個(gè)片段（445 bp）的存在識(shí)別。作為性別診斷的質(zhì)量控制，每個(gè)PCR運(yùn)行中分析無(wú)模板對(duì)照和10pg雌性和雄性DNA以及胚胎樣品。