研究簡介:腫瘤微環(huán)境（TME）在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用，其中CAFs表現(xiàn)出多種促腫瘤效應，能夠誘導腫瘤免疫逃逸和藥物耐受性。CAFs通過分泌細胞因子和趨化因子（如TGF-β、IL-6等）抑制T細胞反應，招募免疫抑制細胞，從而形成免疫抑制性微環(huán)境。因此，調(diào)節(jié)CAFs的表型可能成為增強系統(tǒng)性抗腫瘤免疫的潛在策略。研究人員首先通過體外實驗觀察氫氣對CAFs的影響，發(fā)現(xiàn)氫氣能夠減輕CAFs內(nèi)的活性氧（ROS）水平，下調(diào)一氧化氮合酶（Nos2）的表達，并逆轉(zhuǎn)CAFs的促腫瘤和免疫抑制表型。基于此，研究團隊開發(fā)了Mg-CaCO?系統(tǒng)，利用其在弱酸性TME中快速穩(wěn)定的氫氣釋放能力，實現(xiàn)對CAFs的調(diào)節(jié)。

實驗中，研究團隊制備了Mg-CaCO?棒，并通過掃描電子顯微鏡（SEM）、能量色散X射線光譜（EDS）和X射線衍射（XRD）等技術(shù)對其進行了表征。結(jié)果顯示，Mg-CaCO?棒在pH 6.8的弱酸性環(huán)境中氫氣釋放量顯著增加，表現(xiàn)出良好的pH響應性。在體外實驗中，Mg-CaCO?顯著抑制了4T1腫瘤細胞的活性，并誘導細胞凋亡。其機制是通過破壞線粒體膜電位（MMP）和擾亂細胞內(nèi)氧化還原平衡來實現(xiàn)的。此外，Mg-CaCO?處理的CAFs顯示出較低的ROS水平和Nos2表達，多種CAFs標志物（如Fn1、Col1a1、Vim等）和促腫瘤因子（如Mmp2、Il-6）的表達也顯著下調(diào)。

特別是Cxcl1和Cxcl12的表達被抑制，這兩種因子與CD4?T細胞的免疫抑制表型相關(guān)。在與CD4?T細胞的共培養(yǎng)模型中，Mg-CaCO?處理的CAFs顯著降低了Foxp3的表達和Treg比例，同時增強了免疫激活標志物的表達。在體內(nèi)實驗中，研究團隊通過超聲成像技術(shù)監(jiān)測了Mg-CaCO?在腫瘤內(nèi)的氫氣生成能力，并通過電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）檢測了降解產(chǎn)物。結(jié)果顯示，Mg-CaCO?在腫瘤內(nèi)具有高效穩(wěn)定的氫氣生成能力，且降解產(chǎn)物不會影響全身的鈣和鎂平衡。在Balb/c裸鼠和免疫健全的Balb/c小鼠中，Mg-CaCO?顯著抑制了4T1腫瘤的生長，并通過重塑CAFs表型促進了CD4?T細胞的浸潤。

Unisense氫電極應用

使用Unisense氫電極來檢測Mg、Mg-CaCO?和Mg-OPSZ棒在不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中氫氣的生成情況。實驗分別在pH 7.4（生理條件）和pH 6.8（模擬腫瘤微環(huán)境的弱酸性條件）下進行。氫微電極在超純水中極化過夜，極化電壓為1000 mV。當電壓降至50 mV以下時，電極被插入到一定體積的PBS溶液中。隨后將Mg、Mg-CaCO?或Mg-OPSZ棒加入PBS溶液中，氫氣的生成量每10秒記錄一次。通過實時監(jiān)測氫氣的生成速率和總量，從而評估不同材料在不同環(huán)境條件下的氫氣釋放能力。

實驗結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)氫氣可逆轉(zhuǎn)癌癥相關(guān)成纖維細胞（CAFs）的免疫抑制表型，并基于此開發(fā)了一種腫瘤微環(huán)境（TME）響應的Mg-CaCO?氫治療系統(tǒng)。該系統(tǒng)不僅能直接殺傷腫瘤細胞，還能通過下調(diào)CAFs中促腫瘤和免疫抑制因子（如Nos2、Cxcl1、Cxcl12等），重塑腫瘤基質(zhì)微環(huán)境，增強CD4?和CD8?T細胞的浸潤與活性，將“冷腫瘤”轉(zhuǎn)化為“熱腫瘤”，從而激活系統(tǒng)性抗腫瘤免疫反應。在多種小鼠腫瘤模型中，Mg-CaCO?氫療法顯著抑制了原發(fā)瘤和遠端瘤的生長，提升了血清中免疫激活因子（如IFN-γ、TNF-α）水平，并與免疫檢查點抑制劑（αPD1）聯(lián)用展現(xiàn)出協(xié)同抗腫瘤效應，顯著延長小鼠生存期。Mg-CaCO?氫療法通過重塑CAFs表型和腫瘤免疫微環(huán)境，為治療免疫排斥型“冷腫瘤”提供了一種安全、有效且具備臨床轉(zhuǎn)化潛力的新策略。

圖1、泛癌CAFs的畫像及氫處理反轉(zhuǎn)CAF表型。a）不同TCGA數(shù)據(jù)集中高低CAF特征表達組的總體生存率（OS）。b）熱圖顯示不同TCGA數(shù)據(jù)集中CAF高組上調(diào)基因的富集通路。c）熱圖顯示不同TCGA數(shù)據(jù)集中CAF高組和低CAF組的關(guān)鍵免疫基因表達折疊變化。d）使用transwell體外氫處理模型示意圖。e）條形圖顯示H組DEGs通路富集，與Ctrl組相比。f，g）通過qPCR分析CAFs中CAF中CAF的MRNA水平，包括（H）或未（Ctrl）氫處理（n=3）。h）CAF表型逆轉(zhuǎn)氫處理機制的示意圖示。

圖2、Mg-CaCO3棒的制備與表征。a-d）a）Mg-Opsz棒和b）Mg-CaCO3棒的代表性SEM圖像。比例條：100和1微米，如所示。b，e）局部SEM圖像及（b）Mg-Opsz棒和e）Mg-CaCO3rods中元素的對應分布。c-f）c）Mg-OPSZ棒和f）Mg-CaCO3rods的EDS光譜。g）制備后Mg-CaCO3rods的STEM圖像，顯示Mg、Ca、Si、O和C的元素分布。比例條=100微米。（h）Mg棒、Mg-CaCO棒和納米方解石的XRD圖譜。i）通過氫電極測量PBS中Mg、Mg-OPSZ或Mg-CaCO棒（pH 7.4和pH 6.8）的氫生成。j）通過ICP-MS測量PBS溶液中Mg、Mg-OPSZ或Mg-CaCO3棒的Mg釋放曲線。

圖3、Mg-CaCO3抗腫瘤效果的體外評估。a）4T1細胞在24小時內(nèi)的相對細胞存活率（n=4）。b，c）流式細胞術(shù)分析（b）及相應定量分析（c）通過Annexin V/PI染色4T1細胞凋亡范圍（n=3）。d，e）流式細胞術(shù)測定（d）及BCECF AM探針對4T1細胞pH水平的定量分析（n=3）。f）MB染色4T1細胞氫生成的定性分析。比例桿=50微米。g）對4T1細胞進行不同處理后的熒光顯微鏡圖像，然后用JC-1染料染色。比例桿=25微米。h，i）通過DCFH-DA探針對4T1細胞細胞內(nèi)ROS水平（DCF細胞比率）進行流式細胞術(shù)分析（h）及相應定量分析（i）（n=3）。組別：I組：Ctrl，II：Mg，III：CaCO，IV：Mg-OPSZ，V：Mg-CaCO。統(tǒng)計顯著性通過雙尾學生t檢驗計算。p<0.05，p<0.01，p<0.001。顯示平均值和標準差。

圖4、Mg-CaCO3的CAF重塑和免疫調(diào)節(jié)作用的體外評估。a，b）流式細胞術(shù)測定（a）和相應的定量分析（b）不同處理的CAF中細胞內(nèi)ROS水平（DCF細胞比率）（n=3）。c）不同處理的CAFs的CAF標記蛋白的Western blot分析。d）通過qPCR分析不同處理的CAF中CAF標志物的MRNA水平（n=5）。e）通過qPCR分析不同處理的CAF中Cxcl1和Cxcl12的mRNA水平（n=5）。f，h）使用transwell的體外共培養(yǎng)模型示意圖f）不帶和h）與CD4T細胞（用bioRender.com創(chuàng)建）。g）不同處理的CAF上清液中Cxcl1和Cxcl12水平的濃度定量（n=5）。i）通過qPCR分析與不同處理的CAF共培養(yǎng)的CD4T細胞中Foxp3的MRNA水平（n=5）。j，k）流式細胞術(shù)測定（k）和與不同處理的CAF共培養(yǎng)的CD4T細胞中Treg（Foxp3cell）的相應定量分析（j）（n=5）。組：I：Ctrl，II：Mg，III：CaCO3，IV：Mg-OPSZ，V：Mg-CaCO3。

圖5、Mg-CaCO3的體內(nèi)抗腫瘤和TME重塑作用。a）用Mg-OPSZ和Mg-CaCO3棒瘤內(nèi)給藥后對4T1荷瘤小鼠進行體內(nèi)時間依賴性超聲成像。b）基于超聲成像數(shù)據(jù)對信號強度進行定量分析。c，d）不同治療7天和14天后小鼠腫瘤中的Ca（c）和Mg（d）水平（n=3）。e，i）Balb/c裸體（e）和Balb/c（i）小鼠皮下4T1小鼠腫瘤模型示意圖。f-h）不同處理后Balb/c裸鼠的腫瘤生長曲線（f），腫瘤重量（g）和腫瘤抑制率（h）（n=5）。j-l）不同處理后Balb/c裸鼠的腫瘤生長曲線（j），腫瘤重量（k）和腫瘤抑制率（l）（n=5）。m）不同處理后從Balb/c小鼠采集的腫瘤的H&E，Ki67，TUNEL，DCFH-DA和GSH探針染色的顯微鏡圖像。比例尺=50μm。n）不同治療后從Balb/c小鼠收集的腫瘤的IF圖像。綠色：COL1A1，紅色：CD4，藍色：DAPI，比例尺：200和50μm，如圖所示。

結(jié)論與展望

腫瘤微環(huán)境（TME）在腫瘤進展中起著重要作用。在TME成分中，癌相關(guān)成纖維細胞（CAFs）具有多種促進腫瘤的效應，并可誘導腫瘤免疫逃避和藥物耐藥性。調(diào)控CAFs可作為增強全身抗腫瘤免疫的潛在策略。研究觀察到氫處理可緩解CAFs細胞內(nèi)活性氧，重塑CAFs的腫瘤促進和免疫抑制表型。因此基于CaCO納米顆粒涂層鎂系統(tǒng)（Mg-CaCO3）開發(fā)出可控且對TME有反應的氫治療。

Mg-CaCO3的氫治療不僅能直接殺死腫瘤細胞，還能抑制CAFs中的促腫瘤和免疫抑制因子，從而增強CD4T細胞的免疫活性。原位植入時，Mg-CaCO3可顯著抑制腫瘤生長，將“冷”原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)椤盁帷蹦[瘤，并刺激系統(tǒng)性抗腫瘤免疫，由雙側(cè)腫瘤移植模型中“冷腫瘤”（4T1細胞）和“熱腫瘤”（MC38細胞）得到證實。

該氫治療系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)CAFs的免疫抑制表型，通過重塑腫瘤基質(zhì)微環(huán)境，提供系統(tǒng)性的抗腫瘤免疫刺激策略。Unisense微型氫電極通過高精度的氫氣檢測，為研究提供了氫氣生成速率和總量的定量數(shù)據(jù)。通過長時間監(jiān)測，證明了Mg-CaCO?棒在體內(nèi)能夠持續(xù)穩(wěn)定地釋放氫氣，為氫療法的臨床應用提供了重要依據(jù)。與超聲成像技術(shù)結(jié)合，全面評估了氫療法在體內(nèi)的效果，為后續(xù)的抗腫瘤實驗提供了有力支持。本研究證明了氫療法通過Mg-CaCO?系統(tǒng)能夠有效逆轉(zhuǎn)CAFs的免疫抑制表型，重塑腫瘤基質(zhì)微環(huán)境，并激活系統(tǒng)性抗腫瘤免疫反應。這種療法不僅直接殺傷腫瘤細胞，還能通過調(diào)節(jié)CAFs增強免疫細胞的浸潤和活性，為腫瘤治療提供了一種新的策略。