討論

由于CA是一種無處不在的酶，它從亞硝酸鹽產生NO的能力可能對亞硝酸鹽依賴性信號的控制，特別是對局部血流的控制具有重要意義。大多數已知具有亞硝酸鹽還原酶功能的酶都嚴格依賴于嚴重缺氧或缺氧條件，但存在NADH的黃嘌呤氧化酶和血紅蛋白除外，后者在PO2接近其p50時從亞硝酸鹽生成NO的效率最高，盡管其生理作用受到質疑。如本文所示，CA能夠以較高的速率從亞硝酸鹽生成具有血管活性的NO，而且對低氧并無嚴格要求。這種新的催化活性使CA能夠將新陳代謝活動增加的早期信號(即在氧氣低于臨界水平之前局部pH值下降)轉化為組織氧氣供應的增加，不僅通過玻爾效應促進血紅蛋白的氧氣卸載，還通過產生具有血管活性的NO。

鑒于CA的活性金屬Zn2+不能維持氧化還原活性，這種酶最有可能發揮亞硝酸脫水酶的功能，其反應機制是亞硝酸二階反應，相當于公式1中所示的二氧化碳水合反應的逆反應：

其中，N2O3會迅速同解為NO和NO2，等式2和3中報告的反應機理與之前研究中報告的亞硝酸鹽酸性歧化反應相對應，該反應涉及酸介導和亞硝酸鹽依賴性NO的生成，此處顯示該反應由CA催化。由于氣相中N2O3的不可逆均解作用，用惰性氣體吹掃會使上述平衡向右移動，而在溶液中N2O3和NO處于平衡狀態(K=2×10-5M)，圖2所示的動力學更接近生理條件下達到的平衡。

式2中反應對質子的要求解釋了為什么在低pH值(圖1)下生成更多的產物。反應速率在高pH值時變得更快(圖2)，這表明陰離子亞硝酸鹽(在高pH值時)更有效地參與了催化作用，并進一步表明CA不是亞硝酸鹽還原酶，因為亞硝酸鹽還原酶會提高低pH值時的反應速率。有趣的是，由于與Zn2+結合的氫氧根陰離子比與Zn2+結合的水更容易與二氧化碳發生反應，因此二氧化碳的水合反應在高pH值下也更快。

在多佐胺和乙酰脞胺存在的情況下，NO產物的產量增加，但其形成率卻沒有增加。這兩種磺胺類CA抑制劑是常用的治療藥物，它們與活性位點Zn2+緊密結合，生成一個四面體復合物，占據了CO2結合的疏水袋。多佐胺能阻止二氧化碳的水合作用，但不能阻止亞硝酸鹽的脫水作用，這表明這兩種底物與活性位點中的不同基團結合，并首次表明了亞硝酸鹽與CA之間可能的相互作用模式。多佐胺和乙酰脞胺也有可能通過占據酶的非生產性結合位點來增加對底物亞硝酸鹽的親和力。有趣的是，Cu2+細菌亞硝酸鹽還原酶的活性位點與Zn2+哺乳動物CA的活性位點非常相似，這表明盡管兩種酶的反應機制不同，但可能有相似的氨基酸殘基參與了亞硝酸鹽在這兩種酶中的結合。

早期的CA研究報告顯示，CA與亞硝酸鹽(KI=63mM)、HCO3-(KD=70mM)和CO2(KD=100mM)的結合親和力也很低。由于CA對這些底物的親和力較低，在本文研究的條件下和在體內，只有一小部分酶與底物結合，因此酶的容量很大。因此，CO2的質子水合作用和NO的質子依賴性生成可能在體內同時發生，有氧(CO2)和無氧(H+)代謝的最終產物將增加由內源性亞硝酸鹽形成的NO的數量。

當局部細胞活動突然增加時(如肌肉或神經細胞被激活時)，能夠以相當快的速度做出反應的主要能量生成途徑是糖酵解，它最初幾乎貢獻了所產生的全部額外ATP。因此，局部環境最初會暫時出現乳酸堆積，同時pH值下降，但由于血紅蛋白釋放出O2(玻爾效應)，局部PO2不會顯著下降。因此，局部pH值下降是局部代謝活動增加或灌注不足的最初快速信號。在低pH值條件下(圖1B)，CA從內源性亞硝酸鹽中產生的NO會隨之增加，從而迅速舒張局部血管。亞硝酸鹽轉化為NO的高速常數(pH7.2和5.9時分別為547和84M-1s-1，37℃)支持了CA介導快速擴張血管的能力，該常數遠高于血紅蛋白(pH7.0時為4.4M-1s-1，37℃)和肌紅蛋白(pH7.4時為12.4M-1s-1，37℃)。此外，由于有氧代謝產生的二氧化碳也會降低pH值，CA產生的NO可能有助于維持正常氧合過程中的血管活性NO水平。我們發現多佐胺和乙酰唑胺能增加CA介導的亞硝酸鹽產生的血管活性NO(圖4)，這至少可以部分解釋為什么全身應用乙酰唑胺能增加腦、肺和視網膜的血流量，而與NOS活性無關。乙酰唑胺和多佐胺的這些血管活性作用在很大程度上依賴于可溶性鳥苷酸環化酶的活性(圖4C)，這與之前顯示亞硝酸鹽血管活性受ODQ抑制的結果一致。乙酰唑胺與NO生成有關的作用是否是其治療急性登山病的部分作用，還有待研究。

在不同組織中亞硝酸鹽產生NO的情況不同，這反映了組織特異性CA同工酶的表達具有不同的催化活性和對多佐胺的敏感性，以及在厭氧條件下其他亞硝酸鹽還原途徑的激活。在多佐胺存在下觀察到的NO增加(圖3C)表明，依賴于CA的亞硝酸鹽生成NO的途徑可能在血液中特別活躍，但在肝臟和大腦中也是如此。此外，CAI和CAII異構體都存在于血管壁中，可能參與亞硝酸鹽誘導血管松弛的內在機制。CA表達于多種類型的細胞，包括毛細血管內皮細胞、神經膠質細胞和紅細胞，可溶于水、細胞內、細胞外或與膜結合。最活躍的同工酶CAII在組織中分布廣泛，也是紅細胞中含量第二高的蛋白質，這與圖3B和C中多佐胺對NO生成的巨大影響相一致。與膜結合的CAIV異構體主要在肺毛細血管和腎上皮細胞中表達，受多佐胺的抑制較少，這也可能減少了多佐胺對NO生成的增加(圖3C)。

由于CA定位于血液循環和神經元組織中，因此它的NO生成活性對于至今仍鮮為人知的神經-血管耦合(即通過血液氧水平依賴性功能磁共振成像(BOLD-fMRI)分析神經元處理過程時使用的神經元活動和血管擴張之間的相關性)具有潛在的關鍵重要性。具體來說，最近發現星形膠質細胞糖酵解是調節局部血流以應對大腦神經元活動的決定性因素。除了擴張血管外，NO還參與許多生物過程，包括線粒體消耗氧氣和細胞保護，本文報道的CA產生NO的新功能廣泛擴展了這種無處不在的酶的生理作用以及多佐胺和乙酰唑胺的潛在治療應用。