摘要


無處不在的碳酸酐酶(CA)在催化二氧化碳向碳酸氫鹽和質子的可逆水合過程中，在二氧化碳轉運、酸堿平衡以及將局部酸中毒與血紅蛋白的氧氣卸載聯系起來方面發揮著至關重要的作用。考慮到碳酸氫鹽和亞硝酸鹽之間的結構相似性，我們假設CA使用亞硝酸鹽作為底物來產生強效血管擴張劑一氧化氮(NO)，以增加代謝活躍組織的局部血流量。在這里，我們展示了CA很容易與亞硝酸鹽反應生成NO，尤其是在低pH值條件下，而且反應中生成的NO能誘導主動脈環的血管擴張。這種反應發生在常氧和缺氧條件下，以及CA和亞硝酸鹽處于生理水平的各種組織中。此外，CO2水合作用的兩種特異性抑制劑多佐胺和乙酰唑胺可增加CA催化亞硝酸鹽產生的具有血管活性的NO。這種增強效應可能解釋了這些藥物的已知血管擴張作用，并表明二氧化碳和亞硝酸鹽與酶活性位點的結合方式不同。動力學分析表明，pH值較高時反應速率較高，這表明陰離子亞硝酸鹽更有效地參與了催化反應。總之，我們的研究結果揭示了一種新型的CA亞硝酸酐酶酶活性，這種酶活性可將體內能量代謝的主要最終產物(CO2/H+)與血管活性NO的生成聯系起來。CA介導的NO生成可能對組織中血流與代謝活動之間的相關性非常重要，例如在大腦活躍區域就會出現這種情況。


引言


碳酸歧化酶(CA)是一種含鋅的無處不在的酶，有多種同工酶，可催化有氧代謝的主要最終產物二氧化碳(CO2)可逆地水合轉化為碳酸，形成碳酸氫鹽(HCO3-)和質子：


CO2+H2O→H2CO3→HCO3-+H+(1)


CA除了在酸堿平衡和電解質平衡中發揮重要作用外，還能有效地將血液中的氧氣輸送與組織代謝產生的二氧化碳聯系起來。作為已知速度最快的酶之一，紅細胞中的CA能夠在短時間(0.5秒)內使活躍組織毛細血管中的血液因二氧化碳水化而產生局部pH值下降。這種局部酸中毒會通過玻爾效應降低血紅蛋白的氧氣親和力，從而在氧氣張力不變的情況下將更多的氧氣卸載到活動組織中。


雖然已經發現了許多CA抑制劑，但CO2和HCO3-是該酶唯一已知的底物。鑒于亞硝酸鹽和HCO3-之間的高度相似性(具有相同的三叉平面sp2軌道幾何形狀和幾乎相同的各自酸pKa值(分別為3.4和3.5))，并考慮到亞硝酸鹽已知可與CA的活性位點結合并抑制CO2水合，我們研究了CA使用亞硝酸鹽作為底物生成一氧化氮(NO)這種強效血管擴張劑的可能性。


NO合酶(NOS)生成的大部分氮氧化物會被氧化成亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽在組織中的含量很低。雖然亞硝酸鹽是NO氧化的天然最終產物，但最近的研究表明，亞硝酸鹽也可能是哺乳動物組織中NO的重要來源，尤其是在心血管系統中。目前已發現幾種含金屬的酶，包括球蛋白、黃嘌呤氧化還原酶和線粒體醛氧化酶，它們可在缺氧或缺氧條件下有效催化亞硝酸鹽一電子還原為NO。雖然低氧水平與亞硝酸鹽在組織中轉化為NO之間的復雜耦合關系已得到廣泛研究，但能量代謝的最終產物(尤其是質子)如何調節亞硝酸鹽生成NO的過程尚未完全明了。早期的研究表明，缺血心臟和主動脈血管中的pH值降低導致NO的形成依賴于亞硝酸鹽。莫丁(Modin)等人在一篇開創性論文中首次證明，生理水平的亞硝酸鹽可誘導NO依賴性主動脈血管舒張，尤其是在酸性pH值下，且與NOS活性無關。在這一過程中，亞硝酸鹽轉化為NO的化學(非酶)酸化過程似乎過于緩慢，在體內亞硝酸鹽濃度通常較低的情況下無法發揮主要作用，這表明存在一種特殊的催化劑。在這篇文章中，我們發現CA能在正常氧氣水平和pH值降低的情況下輕易地從亞硝酸鹽生成高水平的血管活性NO。CA的這一新穎生理特性有助于在氧氣張力低于臨界水平之前調節局部血流量，以應對組織代謝活動的增加。


材料與方法


材料。多佐胺(Trusopt)來自默沙東公司。亞硝酸鈉(NaNO2)、亞硝酸鉀(KNO2)、純化的CA(來自牛紅細胞，含有CAII異構體)、去甲腎上腺素(NE)、乙酰膽堿、不對稱二甲基精氨酸、氯化鋅、吲哚美辛和乙酰唑胺來自Sigma Aldrich。純化的CA在100℃下加熱變性10分鐘。按上述方法從純化的CA中制備載脂蛋白酶，用Milli-Q(Millipore)水透析，并進行脂肪化。經丹麥司法部批準，對成年雄性Wistar大鼠(10-12wk)實施斬首和隨后的放血安樂死。用于化學發光的組織立即切除，切成小塊，用冰冷的PBS沖洗血液，勻漿，-80℃保存。從主動脈胸腔部分分離出用于微血管肌電圖等長張力記錄的動脈片段，并將其轉移到冷生理鹽水(見血管舒張實驗)中。

用微型一氧化氮電極測量NO的產生。使用NO100 NO敏感電極(Unisense)在10mM磷酸鹽緩沖液中測量NO含量，溫度為37℃，在開放室中不斷攪拌。一氧化氮電極的響應時間為10秒。多佐胺、KNO2和CA的應用如圖1所示。溶液用毫升Q水配制。用10秒的運行平均值對跡線進行平滑處理。在37℃的厭氧磷酸鹽緩沖液中注入飽和氮氧化物氣體(2mM)的厭氧毫微克水，對電極進行校準。


動力學分析。使用Table Curve 2D軟件對微型一氧化氮電極獲得的動力學軌跡進行非線性最小二乘法擬合分析。


用化學發光法測量NO的產生。實驗在一個裝有10mM磷酸鹽緩沖液和KNO2的反應容器中進行，該容器經過預平衡并用N2吹掃，溫度為37℃，使用西弗斯一氧化氮分析儀(NOA 280i)以4s-1的采樣率檢測氣相中的NO。如圖3所示，應用勻漿組織(2mg/ml)、多佐胺(250μM)和CA(10μM)。通過10秒的運行平均值對蹤跡進行平滑處理，獲得的最大值用于進一步分析。根據制造商的說明，用酸化碘化鉀將已知量的亞硝酸鹽完全還原成NO，進行校準。


血管舒張實驗。實驗使用微血管肌電圖儀進行等張力記錄。如圖4所示，應用NE(0.020μM)、NaNO2(10μM)、牛紅細胞純化CA(10μM)、乙酰唑胺(100μM)和多佐胺(250μM)。PSS含有(以mM為單位)119NaCl、25NaHCO3、4.7KCl、1.18KH2PO4、1.17MgSO4、1.6CaCl2、0.026EDTA和10葡萄糖，用5%CO2-21%O2-74%N2進行平衡，并按之前所述進行裝片、歸一化和活力控制。所有切片均與不對稱二甲基精氨酸(300μM)和吲哚美辛(3μM)孵育30分鐘，以分別抑制內皮NOS和環氧化酶。在選定的實驗中，主動脈節段與選擇性CA抑制劑乙酰唑胺(100μM)或多佐胺(250μM)單獨或與1H-[1,2,4]惡二唑并[4,3-a]喹喔啉-1-酮(ODQ，3μM)聯合孵育30分鐘，以抑制可溶性鳥苷酸環化酶。為誘導動脈節段穩定收縮，在1%O2-5%CO2-94%N2條件下平衡5分鐘后，將NE加入肌電圖室。所使用的抑制劑均不影響NE收縮。活性張力定義為加入NE后的收縮水平減去經過歸一化處理后在PSS中平衡30分鐘后的收縮水平。添加CA和亞硝酸鹽后的張力以活性張力的百分比表示。


統計分析。所有數據均以平均值±SE表示，顯著性水平為P＜0.05，其中n代表單個實驗的次數。數據采用SigmaPlot 11.0軟件(Systat)進行非配對t檢驗分析。