討論


本研究調查了與固定化在鈣藻酸鹽珠中的乳酸乳球菌亞種lactis NCIMB 6681生長和釋放相關的現象。根據先前研究，乳酸在珠內部積累隨著固定化乳酸菌生長。這種積累導致珠內部pH降低，結合高濃度未解離乳酸，最終抑制珠內部生長。在本研究中，這種發展通過連續發酵珠的生物量分布分析證明，因為珠內部濃度在初始發酵期后保持不變。在珠外圍，高生物量濃度在連續發酵前12小時內似乎穩定。在珠表面附近約150μm厚的層中測量到70 g干重l?1的生物量濃度。這些值略低于報道的值在研究固定化在鈣藻酸鹽珠中的L.lactis亞種lactis bv.diacetylactis時。然而，在本研究中，珠的較大部分可能已在每層溶解。數學模擬表明極高濃度的生物量位于珠表面附近非常窄的層中。如果珠的較大部分被溶解，高濃度區域可能已與珠內部較少生物量密度的區域平均。這可能解釋了本研究中觀察到的值與先前報道值之間的差異。


珠表面附近的生物量濃度似乎隨連續發酵延長而穩定。比較連續發酵12和48小時的珠，最外層生物量濃度未觀察到變化。這些觀察與報道的觀察和模擬一致。不同尺寸珠的連續發酵實驗結果表明大多數生長和乳酸生產發生在珠表面附近狹窄范圍內。此區域和珠整體似乎達到穩態生物量濃度。這些觀察表明，當生長發生時，過量生物量釋放到周圍介質中。這種自由細胞釋放可能可取或不可取。已提出幾種方法來減少乳酸菌從藻酸鹽珠釋放。一種方法是在發酵前用蒸餾水、乙醇、Al(NO?)或熱CaCl?溶液沖洗包含固定化乳酸菌的藻酸鹽珠以殺死珠表面附近細菌。另一種方法是應用多層聚L-賴氨酸和藻酸鹽涂層，將細胞釋放減少10倍。還有一種方法研究了使用殼聚糖減少細胞釋放。報道在重復2小時牛奶發酵中，殼聚糖涂層藻酸鹽珠的自由細胞數量比未涂層珠減少。先前研究了順序涂層殼聚糖和藻酸鹽的使用，在整個調查的48小時連續發酵期間減少了體積基準細胞釋放速率。本研究調查了利用擴散限制和相應的固定化生長乳酸菌珠內pH梯度來影響固定化細胞發展及其伴隨釋放的可能性。


乳酸菌的生長速率取決于生長介質中的pH值。測定pH 6.5是自由懸浮L.lactis亞種lactis NCIMB 6681在此培養基中的最適生長pH。當pH升高above 7.5時生長速率迅速下降，在pH 9.00未觀察到生長。在固定化L.lactis亞種lactis發酵中將控制pH從6.50調整到9.25導致細胞釋放速率與乳酸生產速率的比值初始減少約10倍，相比在細菌生長最適pH下運行的發酵。這種發酵pH改變顯然改變了內部pH梯度和L.lactis亞種lactis在珠內的分布模式。從圖7可見，在發酵24小時后測量的珠最外部pH梯度剖面在pH 9.00和9.25下發酵的珠中有顯著差異。在pH 9.25下發酵的珠中，珠最外部0.4 mm內pH僅輕微降低，而pH梯度在pH 9.00下發酵的珠內似乎下降更迅速。在pH 9.25下發酵的珠最外部觀察到的表觀pH閾值層與生物活性小的層一致，因為此層局部pH above 9.00。在此pH下未觀察到自由懸浮L.lactis亞種lactis NCIMB 6681生長。生物量分布分析和不同尺寸珠發酵結果表明大多數生長和乳酸生產發生在珠表面附近當發酵在正常pH下進行時。因此，釋放細胞只需破裂很少凝膠。增加pH似乎將生長最適pH區移向珠中心，遠離表面。如果生長發生在珠內部，釋放細胞必須破裂更多凝膠材料。這種機制可能解釋了在pH 9.25下運行的發酵中觀察到的減少細胞釋放速率。


事實上，視覺檢查在pH 9.25下連續發酵46小時的珠確實揭示了表面下包含大量松散結合生物量的層。固定化細菌的強烈生長似乎削弱了此區域的藻酸鹽凝膠。藻酸鹽凝膠層位于此層外部，有效阻擋了下層生物量的釋放。這種情況可能與用額外無細胞藻酸鹽層涂層珠的發酵甚至藻酸鹽膠囊相比。幾位作者報告了使用額外無細胞藻酸鹽層涂層珠減少細胞釋放。Klinkenberg等人也研究了從包含固定化L.lactis亞種lactis的藻酸鹽涂層藻酸鹽珠的細胞釋放在連續發酵中。在那項研究中，細胞釋放速率與乳酸生產速率的比值顯著減少在整個48小時發酵期間明顯。然而，那些發酵早期階段觀察到的效果不如本研究中觀察到的那么大。


我們的結果表明，可以選擇狹窄的操作pH窗口，促進細胞釋放減少和珠內生物量分布變化。這種效應已在幾個實驗系列中證明，盡管pH測量和控制的變異以及窗口的狹窄給出了效果出現的確切pH值略有不同。發酵介質pH必須控制的方式使得生長速率在自由介質以及珠外圍嚴重抑制，而生長可能在珠內部受pH梯度保護繼續。當介質pH首次增加時，觀察到細胞釋放速率的初始減少。此初始期可能對導致長期減少細胞釋放的過程關鍵。生長和乳酸生產在pH增加時同時減少。由于珠內部產生的乳酸必須擴散出來，珠內部pH降低。這可能保護此區域細胞并允許繼續生長。然而，如果pH增加太高或突然，乳酸生產也將被抑制，保護性pH梯度將消失。如果pH增加太小，外圍細胞生長將暫時抑制，但內部和表面乳酸生產可能降低局部pH足夠恢復外部區域生長和乳酸生產。在此提出的實驗中，在達到選定操作pH前應用了短保持期在pH 6.50下2小時，然后進行單步改變。其他程序可能可行，例如一系列逐步改變以達到操作pH，這可能擴展此pH窗口以產生此處為pH 9.25案例看到的效果。


然而，特殊生長條件的要求可能在某些食品應用中排除這種減少細胞釋放的方法。但是，其他可能應用現在可能由于這種擴展的pH操作范圍而可用。先前已報告固定化乳酸菌在短時間暴露于極端pH值后可以維持高活性。從圖3、5和7的一個有趣觀察是，高細胞釋放和乳酸生產速率維持在通常會導致自由細胞培養生長速率嚴重抑制的pH值。在pH值above 8.5時，自由細胞培養中的生長速率可忽略，而細胞釋放速率和乳酸生產速率在固定化發酵中未顯著影響。事實上，似乎在pH 8.50、8.75和9.00下實現的穩態乳酸生產速率和內部細胞密度大于在pH 6.50下實現的值。這些差異出現即使自由細胞生長應在此貢獻在pH 6.50下測量的細胞釋放速率。在pH 6.50下約18-22%的自由細胞源自反應器中自由細胞生長。在pH值above 8.5時，自由細胞生長可能不顯著貢獻總自由細胞濃度由于發酵broth中的惡劣條件。因此，可能利用擴散限制與伴隨的pH梯度來應用固定化發酵于涉及惡劣條件的工藝，這些條件對固定化生物量提供一定保護和穩定效果，但有效防止污染生物生長。


結論


本研究證明了通過控制外部pH值可以顯著影響固定化乳酸乳球菌在藻酸鹽珠中的分布和釋放行為。將發酵pH從6.5提升至9.25能夠：


?將細胞釋放速率與乳酸生產速率的比值降低近10倍


?使珠內生物量濃度提高5倍


?將乳酸生產速率提升25%


這些發現表明，通過利用固定化系統內產生的pH梯度，可以創造有利于珠內部生長而不利于珠外圍生長的條件，從而有效控制細胞釋放。這種方法不僅為減少細胞釋放提供了新策略，還擴展了固定化細胞技術在惡劣pH條件下的應用潛力，為生物工藝設計提供了重要見解。