摘要

目的：研究乳酸乳球菌亞種lactis在凝膠珠中的生長和釋放，并通過改變生長條件來影響細胞釋放速率。

方法與結果：在連續發酵48小時內，研究了固定化L.lactis亞種lactis在藻酸鹽珠中的釋放速率和分布。將操作pH從6.5改為9.25最初使細胞釋放速率與乳酸生產速率的比值降低了近10倍。與pH 6.5下的發酵相比，在pH 9.25下生長還使珠內最終生物量濃度增加了5倍，并使最終乳酸生產速率增加了25%。48小時后，細胞釋放速率與乳酸生產速率的比值仍比pH 6.5下的發酵低10倍。

結論：將操作pH從6.5改為9.25在48小時發酵期間降低了細胞釋放速率，并提高了最終乳酸生產速率和珠內生物量濃度。

研究意義與影響：這些數據表明，擴散限制和相應的pH梯度可用于影響固定化生長細胞的分布及其伴隨釋放。

引言

固定化細胞技術在生物工藝中具有巨大潛力，細菌固定化已被證明是提高微生物生物反應器性能的有價值工具。一種流行的固定化方法是包埋在凝膠材料中，尤其是海藻凝膠材料如卡拉膠或藻酸鹽。藻酸鹽是一種由D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸組成的線性雜多糖，可以通過多價陽離子如Ca2?或Ba2?交聯。當將細胞和藻酸鈉混合物滴入含多價陽離子的溶液中時，藻酸鹽與多價陽離子的反應形成凝膠珠，其典型孔徑分布為5-200 nm。這提供了一種溫和、簡單且廉價的細菌固定化方法。

固定在藻酸鹽等凝膠中的細菌被凝膠網絡包圍，這強烈限制了它們的運動。當生長發生時，細菌推開凝膠網絡，形成包含密集細菌的菌落。隨著菌落擴張，它可能最終到達凝膠珠表面。這導致菌落爆發，其中菌落內容物釋放到周圍介質中。因此，在凝膠包埋乳酸菌的發酵中，通常有大量自由細胞從固定化基質釋放。這種細胞釋放可能并不總是可取的。因此，一些努力集中在控制固定化生物發酵中的細胞釋放速率。

細胞釋放的機制與細菌在凝膠珠中的生長有關。由于細菌被固定在凝膠材料中，底物和廢物必須通過擴散運輸到和從細菌處。在包含固定化生長細菌的凝膠珠中，情況變得復雜，因為生長細菌暴露于珠內不同的局部環境。研究表明，在鈣藻酸鹽珠中連續發酵固定化乳酸乳球菌亞種lactis 50小時后，95%的生物量位于珠表面附近。數學建模和動力學研究表明，這種效應主要是由于珠內部pH降低所致。這種pH降低導致生長抑制，因為乳酸未解離形式在珠內部積累。珠外圍的細胞受此影響較小。根據提出的模型，珠外圍的細胞濃度可能達到400 g l?1。

本工作的目的是進一步研究固定化細菌在凝膠珠中的生長模式，并應用獲得的知識通過改變生長條件來影響細胞釋放速率。使用控制pH的連續發酵來研究鈣藻酸鹽珠內生物量分布的發展以及包含L.lactis亞種lactis的珠內代謝活性分布。根據先前研究，珠內非均勻生物量分布是由于珠內部pH降低所致。因此，我們檢驗了外部介質pH的變化是否可能影響內部生物量分布和隨后的細胞釋放。生長介質pH升高可能導致生長介質和珠外圍的不利生長條件。在珠內部，生長可能受到乳酸生產產生的pH梯度保護而繼續進行。因此，升高生長介質pH可能用作控制珠細胞釋放的一種方式，甚至可能為固定化細胞開辟新的應用領域，在先前認為超出預期操作范圍的領域。

材料與方法

材料

使用的化學品包括：MRS肉湯、瓊脂、酵母提取物和蛋白胨；Elliker肉湯；CaCl?·H?O、K?HPO?、NaH?PO?、明膠和檸檬酸鈉；葡萄糖一水合物；NaCl；高氯酸；藻酸鈉；乳酸色譜標準和用作高效液相色譜分析的洗脫液H?SO?。

微生物

乳酸乳球菌亞種lactis NCIMB 6681來自國家工業和海洋細菌收藏館。儲備培養物保存在含15%甘油的MRS肉湯中，于-80°C保存。細菌復蘇在Elliker肉湯中于30°C進行12小時。

培養基

使用的培養基包括：發酵培養基：葡萄糖一水合物20.0 g l?1、酵母提取物5.0 g l?1和CaCl?·2H?O 0.75 g l?1。在滅菌前將pH調至6.5。稀釋緩沖液：NaCl 8.5 g l?1、K?HPO?0.3 g l?1、NaH?PO?0.60 g l?1和明膠0.10 g l?1。在滅菌前將pH調至6.5。

細胞固定化

用于固定化的L.lactis亞種lactis細胞在發酵培養基中于30°C控制溫度下生產約14小時。細胞生產在2.5升工作體積的發酵罐中進行，攪拌速度250 rev min?1，pH使用pH控制器自動添加3 mol l?1NaOH維持在6.0。發酵罐接種2%活培養物于Elliker肉湯中。

細胞通過離心在8400 g、4°C下無菌收獲20分鐘。沉淀重懸于稀釋緩沖液中至濃度4 g cells l?1。重懸細胞與等體積4%藻酸鈉溶液混合，得到最終細胞濃度2 g干重cells l?1，用于所有實驗。

藻酸鹽和細胞混合物滴入無菌氯化鈉和氯化鈣溶液中。為了生產直徑3.3 mm的珠，溶液通過內徑0.5 mm的移液器尖頭添加。為確保無菌操作，珠在2.5升工作體積發酵罐中制作，攪拌速率50 rev min?1，使用單斜葉輪。為了生產更小直徑的珠，使用靜電珠發生器。凝膠溶液中使用氯化鈉以確保珠內多糖濃度均勻。為確保完全凝膠化，珠在此溶液中攪拌至少40分鐘。整個固定化程序在環境溫度下進行。

發酵

非固定化L.lactis亞種lactis NCIMB 6681在不同pH值下的批式發酵生長速率在30°C控制溫度下測定。發酵在2.5升工作體積發酵罐中進行，攪拌速度250 rev min?1，pH使用pH控制器自動添加3 mol l?1NaOH維持在4.5-9.0。發酵罐接種2%活培養物于Elliker肉湯中。

固定化L.lactis亞種lactis在藻酸鹽珠中的連續發酵使用100 ml珠在總工作體積550 ml的反應器中進行，操作攪拌速率300 rev min?1，控制溫度30°C。發酵培養基用作連續發酵的進料培養基。為了最小化自由細胞生長對反應器自由細胞濃度的貢獻，發酵在稀釋率4 h?1下操作。在這些條件下，反應器中不到20%的葡萄糖進料轉化為乳酸。pH使用pH控制器自動添加1 mol l?1NaOH維持在5.5、6.5、7.5、8.5、8.75、9.0和9.25。溫度、pH、每個反應器流出和NaOH添加由計算機連續記錄。

細胞濃度測定

自由懸浮細胞在批式培養中生長速率的細胞密度通過測量培養物在660 nm的光密度監測。樣品用蒸餾水稀釋至最終光密度小于0.4，蒸餾水用作空白。

固定化L.lactis亞種lactis發酵中自由細胞濃度測定的樣品用稀釋緩沖液系列稀釋。平板計數在每個稀釋度下三重進行，在補充1.5%瓊脂的MRS肉湯上。平板在30°C培養2天。結果根據指南計算，報告為cfu ml?1。根據指南進行測試以確保足夠的重現性。

用于測定內部細胞密度的固定化L.lactis亞種lactis珠樣品從發酵broth中分離，并在無菌1%檸檬酸鈉溶液中液化。稀釋和平板計數如上所述進行。