3.2.CBS和CSE產生的H2S抑制胎盤中sFlt-1生產

我們之前的研究顯示，H2S供體NaHS和前體L-半胱氨酸抑制培養(yǎng)外植體中sFlt-1釋放。鑒于sFlt-1主要由胎盤合胞體滋養(yǎng)層細胞合成和分泌，我們調查了H2S對培養(yǎng)合胞體滋養(yǎng)層細胞中sFlt-1生產的影響。如圖3A&B所示，用H2S供體NaHS（1-8 x 10^-5 M）和H2S前體L-半胱氨酸（0.25-2 x 10^-3 M）處理培養(yǎng)合胞體滋養(yǎng)層細胞，導致sFlt-1蛋白釋放和mRNA表達劑量依賴性減少。

圖3. 硫化氫調節(jié)人胎盤細胞中sFlt-1的產生。A&B，硫氫化鈉和L-半胱氨酸對培養(yǎng)胎盤細胞中sFlt-1產生的影響。細胞用不同濃度的硫氫化鈉和L-半胱氨酸處理24小時。通過 ELISA 檢測培養(yǎng)基中sFlt-1的蛋白水平。通過實時RT-PCR測定細胞中sFlt-1的mRNA水平。C，L-半胱氨酸對CBS或CSE敲低細胞中sFlt-1產生的影響。細胞轉染對照siRNA、CBS siRNA或CSE siRNA后，用L-半胱氨酸（2×103 M）處理24小時。通過 ELISA 檢測培養(yǎng)基中sFlt-1的蛋白水平。數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示（n ? 4個培養(yǎng)物）。*P < 0.05，**P < 0.01 vs 載體對照或指定。

我們然后使用siRNA方法調查了CBS和CSE是否貢獻L-半胱氨酸對胎盤細胞中sFlt-1生產的影響。首先，我們確認了培養(yǎng)合胞體滋養(yǎng)層細胞能夠產生H2S，并且H2S生產率在存在CSE抑制劑PAG或CBS抑制劑AOAA時被抑制。然后，我們顯示L-半胱氨酸（2 x 10^-3 M）處理在轉染CSE siRNA或CBS siRNA的細胞中不能抑制sFlt-1生產（圖3C）。

3.3.MiR133b參與H2S對sFlt-1的效應

由于H2S抑制sFlt-1轉錄水平，我們然后通過評估sFlt-1 mRNA的半衰期檢查H2S是否影響sFlt-1 mRNA穩(wěn)定性。如圖4A&B所示，在存在mRNA合成抑制劑DRB（2.5 x 10^-5 M）的情況下，NaHS和L-半胱氨酸降低了sFlt-1 mRNA的半衰期。

圖5. 可溶性Flt-1是miR-133b的直接靶標。A，miR-133b模擬物對胎盤細胞中sFlt-1基礎水平的影響。細胞經(jīng)miR-133b模擬物處理24小時后，分別通過實時RT-PCR和 ELISA 檢測細胞內sFlt-1的mRNA水平及培養(yǎng)基中sFlt-1的蛋白濃度。B，miR-133b抑制劑對胎盤滋養(yǎng)層細胞中sFlt-1基礎水平的影響。細胞經(jīng)miR-133b抑制劑處理24小時后。C，sFlt-1基因30個非翻譯區(qū)（UTR）中預測的miR-133b靶序列及其突變核苷酸。D，含sFlt-1基因30個UTR及其突變核苷酸的報告基因熒光素酶活性檢測。胎盤滋養(yǎng)層細胞轉染上述報告基因后，分別在有無miR-133b模擬物的條件下進行檢測。使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定細胞裂解液中的熒光素酶活性。數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示（n ? 4組培養(yǎng)）。*P < 0.05，**P < 0.01 vs 載體對照組。

MiR可以通過其種子序列（5'端核苷酸2-8）與互補位點結合來降解mRNA靶點。生物信息學分析顯示，靶向sFlt-1的miR包括miR-133b、-182和-190。先前研究報道了先兆子癇胎盤中miR133b的變化。如圖4C&D所示，NaHS（2-8 x 10^-5 M）和L-半胱氨酸（0.5-2 x 10^-3 M）以劑量依賴性方式增強胎盤滋養(yǎng)層細胞中miR-133b表達。

我們然后通過使用這些miR的模擬物和抑制劑以及sFlt-1-3'-UTR-熒光素酶報告assay確認sFlt-1是miR-133b的直接靶點。如圖5A&B所示，轉染miR-133b模擬物導致sFlt-1 mRNA表達和sFlt-1蛋白釋放減少，而miR-133b抑制劑增加細胞中sFlt-1 mRNA水平和蛋白釋放。熒光素酶報告assay確認miR-133b靶向sFlt-1（圖5C&D）。

圖5. 可溶性Flt-1是miR-133b的直接靶標。A，miR-133b模擬物對胎盤細胞中sFlt-1基礎水平的影響。細胞經(jīng)miR-133b模擬物處理24小時后，分別通過實時RT-PCR和 ELISA 檢測細胞內sFlt-1的mRNA水平及培養(yǎng)基中sFlt-1的蛋白濃度。B，miR-133b抑制劑對胎盤滋養(yǎng)層細胞中sFlt-1基礎水平的影響。細胞經(jīng)miR-133b抑制劑處理24小時后。C，sFlt-1基因30個非翻譯區(qū)（UTR）中預測的miR-133b靶序列及其突變核苷酸。D，含sFlt-1基因30個UTR及其突變核苷酸的報告基因熒光素酶活性檢測。胎盤滋養(yǎng)層細胞轉染上述報告基因后，分別在有無miR-133b模擬物的條件下進行檢測。使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定細胞裂解液中的熒光素酶活性。數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示（n ? 4組培養(yǎng)）。*P < 0.05，**P < 0.01 vs 載體對照組。

3.4.MiR-133b在先兆子癇胎盤中下調

如圖6所示，先兆子癇胎盤中miR-133b水平顯著低于正常胎盤（P<0.01）。miR-133b水平與CSE和CBS表達相關（P<0.05）。

圖6. 正常與子癇前期胎盤中miR-133b的表達水平及其與CBS或CSE水平的相關性分析。A、正常胎盤（n ? 23）與子癇前期胎盤（n ? 19）中miR-133b的表達情況。B、胎盤中CBS與miR-133b水平的相關性分析。C、CSE表達與miR-133b表達的相關性分析。數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示。*P<0.05，**P<0.01。PE：子癇前期。

4.討論

本研究證明，H2S合成酶CBS、CSE和3-MST在人胎盤合胞體滋養(yǎng)層細胞中有表達。CSE和CSE產生的H2S抑制合胞體滋養(yǎng)層細胞中sFlt-1生產，且H2S的該效應依賴于miR-133b的表達。

3-MST被報道能夠在大腦和血管內皮中從L-半胱氨酸生成H2S。本研究首次顯示3-MST在人胎盤中有表達，并主要定位在合胞體滋養(yǎng)層細胞。如所述，關于胎盤中CSE和CSE定位可能存在爭議。Cindrova-Davies等人證明CBS主要定位在合胞體滋養(yǎng)層細胞，而CSE定位在動脈平滑肌細胞。Wang等人顯示CSE定位在合胞體滋養(yǎng)層和內皮。相反，Holwerda等人報道CBS和CSE蛋白在胎兒-胎盤內皮中表達。這種差異可能由于個別組使用的CSE和CSE抗體來自不同公司。為了確認胎盤中CSE和CSE定位，本研究使用了來自兩個公司的CBS和CSE抗體。我們的結果證明，由任一抗體識別的CSE和CSE陽性3-MST已被報道能夠在大腦和血管內皮中從L-半胱氨酸生成H2S。本研究首次顯示3-MST在人胎盤中有表達，并主要定位在合胞體滋養(yǎng)層細胞。如所述，關于胎盤中CSE和CBS定位可能存在爭議。Cindrova-Davies等人證明CBS主要定位在合胞體滋養(yǎng)層細胞，而CSE定位在動脈平滑肌細胞。Wang等人顯示CSE定位在合胞體滋養(yǎng)層和內皮。相反，Holwerda等人報道CBS和CSE蛋白在胎兒-胎盤內皮中表達。這種差異可能由于個別組使用的CSE和CBS抗體來自不同公司。為了確認胎盤中CSE和CBS定位，本研究使用了來自兩個公司的CBS和CSE抗體。我們的結果證明，由任一抗體識別的CSE和CBS陽性染色在合胞體滋養(yǎng)層和內皮中被鑒定。

我們之前的研究已證明，H2S對胎盤細胞中sFlt-1釋放的抑制與Flt-1脫落過程的抑制相關。在本研究中，我們顯示CSE和CBS負責內源性H2S對胎盤細胞中sFlt-1釋放和mRNA表達的抑制。此外，我們還發(fā)現(xiàn)H2S通過降低sFlt-1 mRNA穩(wěn)定性來減少sFlt-1轉錄本，表明H2S對sFlt-1生產的調節(jié)可在轉錄后水平發(fā)生。鑒于miR可通過結合不完全配對來降解mRNA靶點，且我們之前研究已顯示H2S可影響胎盤細胞中靶向VEGF的miR表達，我們探討了H2S是否影響靶向sFlt-1的miR表達。發(fā)現(xiàn)H2S增強了靶向sFlt-1 mRNA的miR-133b表達，表明調節(jié)miR-133b表達是H2S抑制胎盤中sFlt-1生產的機制之一。

越來越多的證據(jù)表明，胎盤中sFlt-1生產增加在先兆子癇的發(fā)展和進展中起重要作用。然而，胎盤中sFlt-1生產增加的機制仍largely未知。我們的研究證明，通過CSE和CBS產生的內源性H2S是胎盤中sFlt-1生產調節(jié)的重要負性因子。此外，我們還發(fā)現(xiàn)胎盤中CSE和CBS表達水平與sFlt-1表達顯著相關。鑒于CSE和CBS表達在先兆子癇胎盤中被下調，表明CSE和CBS功能障礙可能至少部分導致先兆子癇患者循環(huán)中sFlt-1水平升高。

我們之前研究已顯示H2S抑制靶向VEGF的miR表達。相反，本研究顯示H2S增強了miR-133b表達。本研究的局限性在于未回答H2S對不同miR產生相反效應的分子基礎。H2S已被涉及誘導各種蛋白質中半胱氨酸殘基的S-硫水化和二硫鍵。因此，研究H2S是否誘導負責調節(jié)不同miR表達的蛋白質功能變化是很有意義的。

5.結論

我們的結果表明，通過CSE和CBS產生的H2S在調節(jié)人胎盤中sFlt-1生產中起關鍵作用。胎盤中CSE和CBS表達減少可能有助于先兆子癇胎盤中sFlt-1生產升高。