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2.4.總RNA提取和定量實時RT-PCR
總RNA提取和定量實時RT-PCR如先前所述進行。簡要地，總RNA通過TRIzol試劑（Invitrogen）提取，然后通過超轉錄逆轉錄酶（Invitrogen）逆轉錄生成cDNA。定量實時PCR使用MiniOpticonTM實時PCR檢測系統（BioRad,Hercules,CA）進行。反應溶液由2.0μl稀釋cDNA、0.2μM每對引物和1x PCR Master Mix（TaKaRa,Otsu,Japan）組成。管家基因β-肌動蛋白和18s-RNA的擴增作為樣品加載和標準化的內參測量。檢測PCR產物熔解溫度的溫度范圍設定為60至95°C。使用比較Ct（閾值循環）方法與算術公式（2^-ΔΔCt）確定靶基因和管家基因的相對定量。
胎盤組織和細胞的總miR使用miRcute miRNA分離試劑盒（TIANGEN,China）根據制造商說明提取。總miRNA的第一鏈cDNA合成使用miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒（TIANGEN,China）進行。miR的定量通過miRcute miRNA qPCR檢測試劑盒（TIANGEN,China）進行。管家基因U6的擴增作為樣品加載和標準化的內參測量。檢測PCR產物熔解溫度的溫度范圍設定為60至95°C。使用比較Ct方法與算術公式（2^-ΔΔCt）確定miR表達的相對定量。
本研究中使用的引物如表1所示。
| 登錄號 | 靶基因 | 方向 | 引物序列 (5′→3′) |
|---|---|---|---|
| NM_001101 | β-actin | 正義 | TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG |
| NM_001101 | β-actin | 反義 | GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG |
| NM_001159920 | sFlt-1 | 正義 | TTGGGACTGTGGGAAGAAC |
| NM_001159920 | sFlt-1 | 反義 | TTGGAGATCCCAGAGAAAACA |
| NR_003286.3 | 18s-RNA | 正義 | CAGCCACCCGACGATTGAGCA |
| NR_003286.3 | 18s-RNA | 反義 | TAGTAGCGACGGGCGGTGTG |
| NR_004394.1 | U6 | 正義 | GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT |
| NR_004394.1 | U6 | 反義 | CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT |
| MI0000822 | miR-133b | 正義 | TTTGGTCCCCTTCAACCAGCTA |
2.5.蛋白質印跡分析
約100 mg組織在含蛋白酶抑制劑混合物片（Roche,Indianapolis,IN）的冷RIPA裂解緩沖液中勻漿。培養細胞在存在上述緩沖液的情況下從板上刮下。30μg蛋白樣品通過10%SDS-PAGE分離，隨后轉移到硝酸纖維素膜上。膜在4°C下與針對CBS（Abcam）、CSE（Abcam）或3-MST（Santa Cruz）的抗體孵育過夜，然后洗滌并與辣根過氧化物酶偶聯的二抗（Santa Cruz）孵育。免疫反應蛋白通過增強化學發光蛋白質印跡檢測系統（Santa Cruz）可視化。化學發光信號通過GeneGnome HR掃描儀使用GeneTools軟件（SynGene）定量。獲得條帶強度與GAPDH的比率以量化相對蛋白表達水平。
2.6.實時H2S生產測量
約100 mg胎盤組織或培養細胞樣品置于含蛋白酶抑制劑（2 mM苯甲基磺酰氟、1 mM原釩酸鈉和10μg/ml抑肽酶）的PBS中冰上。組織勻漿并在4°C離心，然后收集上清液。實時H2S生產動力學通過使用微型硫化氫電極（Model H2S-MRCh,Unisense,Aarhus,Denmark）耦合到Unisense PA2000放大器（Zhu等人，2013）測定。
簡要地，測量在溫度控制的微呼吸室（Unisense）中進行。電極信號穩定后，添加L-半胱氨酸（1 mmol/L）和吡哆醛-5'-磷酸（PLP,1 mmol/L），一種生成H2S的輔因子。H2S生產率然后在每條軌跡的最陡初始斜率處確定。在某些情況下，添加CSE抑制劑DL-丙炔甘氨酸（PAG）和CBS抑制劑氨基氧乙酸半鹽酸鹽（AOAA）。所有上述試劑購自Sigma-Aldrich。
2.7.RNA干擾
針對CSE和CBS的siRNA由GenePharma公司（Shanghai,China）合成。對照siRNA是無任何特定靶點的亂序序列。針對人CSE和CBS的序列為：CSE正義：5'-GGCCUUUGCUUCAGGUUUATT-3'，反義：5'-UAAACCUGAAGCAAAGGCCTT-3'；CBS正義：5'-CGGAACUACAUGACCAAGUTT-3'，反義：5'-ACUUGGUCAUGUAGUUCCGTT-3'。原代胎盤滋養細胞使用LipofectamineTM 2000（Invitrogen）轉染CSE siRNA、CBS siRNA和對照siRNA。我們已顯示CSE和CBS siRNA分別導致CSE減少約65%和CBS減少約70%。轉染CBS siRNA和CSE siRNA后，細胞然后用L-半胱氨酸處理，孵育24小時后收集培養基。
2.8.sFlt-1 mRNA穩定性評估
原代滋養細胞用NaHS（8 x 10^-5 M）和L-半胱氨酸（2 x 10^-3 M）處理12小時。然后通過5,6-二氯苯并咪唑1-β-d-ribofuranoside（DRB,Sigma-Aldrich）在2.5 x 10^-5 M停止轉錄。細胞在離散時間點（0-8小時）收集。
2.9.miR靶點驗證
胎盤細胞在48孔板中培養24小時，然后用miR模擬物或抑制劑（20nM/孔）轉染24小時使用LipofectamineTM 2000。收集細胞和培養基用于測定培養基中sFlt-1蛋白水平和細胞中mRNA水平。miR-133b的模擬物和抑制劑由Gene Pharma公司（Shanghai,China）合成。
sFlt-1的3'-UTR片段（600bp）含miR-133b結合位點和突變sFlt-1的3'-UTR片段插入Psi-CHECK2載體（Promega）。胎盤細胞在存在或不存在miR-133b模擬物的情況下使用Lipofectamine TM 2000共轉染上述質粒。轉染24小時后，使用雙熒光素酶報告系統（Promega）測量螢火蟲和海腎熒光素酶活性。螢火蟲熒光素酶活性標準化為海腎熒光素酶活性。
2.10.統計分析
數據表示為平均值±標準誤。在某些情況下，結果為說明目的表示為平均百分比對照±標準誤。所有數據在分析顯著性前通過Bartlett檢驗進行方差齊性檢驗。個體比較通過單因素方差分析后進行LSD-t檢驗（對于正態分布數據）。對于非正態分布數據，使用非參數顯著性檢驗。在所有檢驗中，P<0.05被認為顯著。
3.結果
3.1.3-MST在胎盤中有表達
我們確認了CBS和CSE在胎盤中有表達。CSE和CSE的陽性染色在合胞體滋養層細胞和血管內皮細胞中發現（圖1A&B）。3-MST在胎盤中被鑒定，并定位到合胞體滋養層細胞（圖1C）。由于一些研究顯示關于人胎盤中CSE和CSE定位的矛盾數據，我們使用來自兩個公司的CSE和CSE抗體進行免疫組化。顯示，由任一抗體識別的CSE和CSE免疫反應性主要定位在合胞體滋養層和內皮（圖1）。
圖1. 人胎盤中CBS、CSE和3-MST的表達情況。A-F圖通過免疫細胞化學分析展示了健康胎盤與子癇前期胎盤中CBS（A&D）、CSE（B&E）和3-MST（C&F）的陽性染色代表性切片。G-I圖顯示陰性對照切片，這些切片使用與對應阻斷肽（G&H）或IgG(I)預孵育10倍過量的一抗制備。箭頭指示合體滋養層細胞的陽性染色，箭頭頭指示血管內皮細胞的陽性染色。原始放大倍數為200倍。
我們之前的研究顯示，先兆子癇胎盤中CBS和CSE的蛋白水平顯著低于健康胎盤。一致地，免疫組化顯示，先兆子癇胎盤中CBS和CSE的免疫染色水平低于正常血壓胎盤（圖1A&D,B&F）。我們然后測定了先兆子癇胎盤中3-MST的水平，并與正常血壓胎盤比較。如圖2A&B所示，3-MST mRNA和蛋白表達在健康和平先兆子癇胎盤之間無顯著差異。為了確認先兆子癇胎盤中H2S生產是否減少，進行了H2S生產測量。發現先兆子癇胎盤中H2S生產率顯著降低（圖2C,P<0.01 vs正常組）。
圖2. 健康與子癇前期胎盤中3-MST和硫化氫生成速率的水平。胎盤組織取自健康（n ? 23）和子癇前期（n ? 19）孕婦。A，通過實時RT-PCR測定3-MST的mRNA水平。B，通過Western blotting測定3-MST的蛋白水平。代表性蛋白條帶顯示在相應直方圖頂部。C，人類正常與子癇前期胎盤中硫化氫的生成速率。上圖，胎盤組織勻漿中硫化氫生成的代表性曲線。下圖，正常與子癇前期胎盤中硫化氫生成速率的累積數據。數據以均值±標準誤表示。**P < 0.01。
