摘要

胎盤產(chǎn)生的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1(sFlt-1)增加是先兆子癇發(fā)展的主要因素之一。我們之前的研究表明，硫化氫(H2S)抑制胎盤中sFlt-1的釋放。在本研究中，我們旨在調(diào)查內(nèi)源性H2S是否影響sFlt-1的生產(chǎn)，并闡明胎盤中哪種H2S生成酶負責其效應。研究發(fā)現(xiàn)，除了胱硫醚β-合酶(CBS)和胱硫醚γ-裂解酶(CSE)外，3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(3-MST)也在人胎盤中被鑒定，主要定位在合胞體滋養(yǎng)層細胞中。先兆子癇和正常胎盤中3-MST的表達水平無顯著差異。用NaHS和L-半胱氨酸處理培養(yǎng)的合胞體滋養(yǎng)層細胞，可抑制sFlt-1 mRNA表達，并降低細胞培養(yǎng)基中sFlt-1蛋白含量。用CBS siRNA和CSE siRNA轉(zhuǎn)染合胞體滋養(yǎng)層細胞，可逆轉(zhuǎn)L-半胱氨酸的上述效應。此外，NaHS和L-半胱氨酸處理降低了sFlt-1 mRNA的半衰期，并增加了靶向sFlt-1的miR-133b的表達。MiR-133b表達在先兆子癇胎盤中下調(diào)，并與CBS和CSE水平相關(guān)。這些結(jié)果表明，H2S是胎盤中sFlt-1生產(chǎn)的重要調(diào)節(jié)因子。胎盤中H2S生成減少通過增強sFlt-1生產(chǎn)促進先兆子癇的發(fā)展。

1.引言

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)配體/受體在正常和病理狀態(tài)下對內(nèi)皮功能起關(guān)鍵作用。大量研究表明，循環(huán)中可溶性fms樣酪氨酸激酶-1(sFlt-1)水平增加是先兆子癇中高血壓和蛋白尿發(fā)展的主要因素之一，因為該因子作為VEGF和胎盤生長因子(PlGF)的拮抗劑，通過使它們無法與膜結(jié)合受體信號傳導，從而導致內(nèi)皮功能障礙。胎盤被認為是正常妊娠第三季度循環(huán)sFlt-1水平增加約20倍的主要來源。許多研究表明，sFlt-1的生產(chǎn)在先兆子癇胎盤中顯著上調(diào)，從而導致母體循環(huán)sFlt-1顯著增加。盡管已證明胎盤缺氧和缺血會增加胎盤產(chǎn)生sFlt-1，但調(diào)節(jié)胎盤中sFlt-1生產(chǎn)的機制仍不清楚。

硫化氫(H2S)是哺乳動物組織中的第三種內(nèi)源性氣體信號傳導分子，最近被報道由胎盤組織產(chǎn)生。H2S從L-半胱氨酸的合成自然通過酶活性發(fā)生，包括胱硫醚γ-裂解酶(CSE,EC 4.4.1.1)和胱硫醚β-合酶(CBS,EC 4.2.1.22)。最近，已證明3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(3-MST)與半胱氨酸（天冬氨酸）氨基轉(zhuǎn)移酶(CAT)結(jié)合，負責在大腦和血管內(nèi)皮中從L-半胱氨酸生成H2S。H2S被涉及許多生理和病理過程，包括血管舒張、血管生成和炎癥。一些研究報道，CSE和CBS在人胎盤中表達，并在先兆子癇中下調(diào)。此外，Wang等人證明，抑制CSE/H2S信號傳導會導致懷孕小鼠出現(xiàn)先兆子癇特征，包括高血壓和循環(huán)sFlt-1水平增加，并且通過CSE siRNA降低CSE表達會導致早期胎盤外植體內(nèi)皮細胞中sFlt-1釋放增加。最近，我們已顯示H2S供體和前體抑制人胎盤中sFlt-1釋放。然而，哪種H2S生成酶負責其效應以及H2S效應的潛在機制仍有待闡明。盡管CSE和CBS已在胎盤中被鑒定，但3-MST是否在胎盤中有表達尚未報道。在本研究中，我們首先確定了3-MST在人胎盤中的定位，以及正常和先兆子癇胎盤中3-MST的表達水平。然后我們研究了H2S對培養(yǎng)胎盤外植體和細胞中sFlt-1釋放和mRNA表達的影響，并闡明了潛在機制。

2.材料與方法

2.1.組織獲取

人胎盤組織來自2010年至2012年在第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院接受選擇性剖宮產(chǎn)的先兆子癇孕婦和健康孕婦。組織收集經(jīng)第二軍醫(yī)大學生物醫(yī)學研究倫理專業(yè)委員會批準。獲得所有患者的知情同意。本研究招募了足月健康女性(n=23)和先兆子癇女性(n=19)。這些患者的妊娠和先兆子癇指數(shù)信息先前已報道。所有胎盤樣本在剖宮產(chǎn)后1小時內(nèi)收集，每個胎盤隨機取兩個獨立小葉的小組織塊。組織用生理鹽水洗滌，立即在液氮中冷凍，然后儲存于-80°C。

2.2.免疫組化

免疫組化如先前所述進行。簡要地，切片在4°C下與針對CSE、CBS或3-MST的抗體（稀釋1:200-500）在含1%BSA的PBS中孵育24小時。結(jié)合的抗體通過生物素-鏈霉親和素-過氧化物酶系統(tǒng)（UltraSensitive-SP-kit,MaiXin Biotechnology,Fuzhou,China）檢測，使用二氨基聯(lián)苯胺（Sigma-Aldrich,St.Louis,MO）作為顯色劑。用蘇木精進行復染。陰性對照通過用十倍過量的阻斷肽預吸收一抗進行替代。使用了來自Santa Cruz（Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA）和Abnova（Novus Biologicals,Cambridge,UK）的兩種CSE抗體，以及來自Santa Cruz和Sigma-Aldrich的兩種CBS抗體。3-MST抗體購自Santa Cruz。

2.3.胎盤細胞培養(yǎng)

原代滋養(yǎng)細胞根據(jù)改良的Kliman方法培養(yǎng)，如先前所述。簡要地，絨毛組織切碎，然后用0.125%胰蛋白酶（Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA）和0.02%脫氧核糖核酸酶-I（Sigma-Aldrich）在無酚紅DMEM（Sigma-Aldrich）中消化。分散細胞中的細胞滋養(yǎng)細胞通過不連續(xù)Percoll（Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden）梯度（5-70%）獲得。然后將細胞以1.2 x 10^6/孔的密度接種到十二孔板（Corning）中，并在含10%胎牛血清（FCS）的無酚紅DMEM中于37°C、5%CO2-95%空氣下生長。孵育48小時后，培養(yǎng)基更換為含以下處理之一的無FCS DMEM：NaHS（1-8 x 10^-5 M）和L-半胱氨酸（2.5-20 x 10^-4 M）。每種處理在每次細胞制備中重復三次。上述試劑的濃度基于文獻、我們之前的研究和初步數(shù)據(jù)確定。培養(yǎng)細胞固定并用針對細胞角蛋白7的一抗（Santa Cruz）以1:200稀釋進行免疫染色以評估細胞純度。結(jié)果顯示胎盤細胞培養(yǎng)主要為細胞角蛋白7陽性（>95%）。