討論


升高血清NEFA濃度，源于上調的脂解作用，已被牽連為代謝失衡、細胞功能障礙和相關病理之間關聯的關鍵因素。在此背景下，我們使用牛模型證明，卵母細胞成熟期間升高NEFA濃度對胚胎質量有深遠負面影響；這些效應在NEFA暴露移除后約七天仍持續，表現在囊胚形成、存活力、代謝和基因轉錄。


牛作為早期哺乳動物繁殖模型的支持，特別是對人類，在過去十年中穩步增長。人類和牛是單排卵者，且人類和牛卵巢功能和卵母細胞特征密切相似，與嚙齒類和人類之間卵巢生理和生殖功能的重大差異相反。牛和人類胚胎在微管時序、基因組激活、代謝需求、與培養基的相互作用和植入前發育持續時間方面非常相似，這使得牛成為人類生殖研究的優秀模型。

我們的數據顯示，卵母細胞成熟期間升高NEFA暴露不損害合子達到2細胞階段的能力。然而，能夠形成囊胚的HIGH NEFA暴露卵母細胞數量減少。在牛和人類胚胎中，前3-4次卵裂的發育過程在母體來源的mRNA和蛋白質控制下進行，直到主要胚胎基因組激活（EGA）在8-16細胞階段發生。形成囊胚的減少表明卵母細胞發育期間NEFA暴露對基因組激活后發育以及EGA后基因轉錄模式有顯著負面影響。最近關于肥胖雌性小鼠模型的研究數據進一步支持升高NEFA濃度有助于代謝狀態受損女性生育力下降的命題。


來自HIGH NEFA暴露卵母細胞的囊胚總細胞數顯著減少，相應凋亡細胞比率增加，與對照相比。普遍認為飽和NEFA如PA（C16:0）和SA（C18:0）可直接施加負面效應于細胞存活力。在當前工作中，與來自HIGH COMBI或對照培養基成熟卵母細胞的胚胎相比，來自HIGH SA培養基成熟卵母細胞的囊胚凋亡細胞比率顯著更高。這些發現的一種解釋是，HIGH COMBI混合物中存在的不飽和OA（C18:1）可能補償飽和NEFA（PA和SA）在COMBI混合物中誘導的負面效應。這一命題與Aardema等人的近期發現大體一致，他們認識到OA防止飽和脂肪酸的有害效應。


NEFA暴露during oocyte maturation也影響結果囊胚的基因表達模式。HIGH COMBI胚胎中SLC2A1基因的相對mRNA豐度顯著增加；這是細胞應激的典型指示。此外，HIGH COMBI囊胚中DNMT3A基因顯著上調。該基因編碼從頭DNA甲基轉移酶，其調控在植入前發育期間對于正確建立表觀遺傳標記至關重要。在植入前發育期間發生的表觀遺傳事件中，基因組印跡的建立對后續胎盤形成和胚胎發育至關重要。IGF2R是眾所周知的母體印跡基因，其失調導致胎盤形成和胎兒生長紊亂。在這方面，我們觀察到與當前研究中其他處理相比，該基因在HIGH COMBI胚胎中顯著上調。未發現凋亡相關基因如BAX、SHC1和TP53的相對mRNA豐度差異，這可能表明囊胚中觀察到的增加凋亡細胞指數可能起源于發育早期。此外，有人提出胚胎中凋亡相關基因的翻譯和翻譯后調控似乎比轉錄調控更重要。


2002年，“安靜胚胎假說”被提出，該假說陳述最存活的早期胚胎表現出“更安靜”的代謝，在氨基酸方面得到很好說明。這種一般模式已在牛、豬和人類胚胎中報告，并被認為是胚胎存活力的通用標記。此外，卵裂期胚胎氨基酸代謝數據預測形成囊胚的能力，并與牛和人類胚胎的存活力相關。我們因此測定了來自在升高NEFA存在下成熟卵母細胞的囊胚的氨基酸譜。與對照相比，HIGH SA和HIGH COMBI胚胎顯示升高氨基酸代謝，并且最可能比對照更不存活。在HIGH SA胚胎中，增加氨基酸代謝伴隨核碎片增加，反映在更高凋亡細胞比率，證實了牛囊胚中先前發現，即升高代謝與DNA損傷相關。


越來越認識到卵母細胞和胚胎代謝與后續發育能力密切關聯。氧氣消耗提供全局代謝活動的指標，并先前被確定為牛胚胎的重要存活力指標。與上調氨基酸代謝相反，我們觀察到HIGH SA和HIGH COMBI胚胎中氧化代謝減少，表明氧氣消耗必須處于某個閾值以維持適當ATP水平，因為慢性低ATP含量可能是看似正常人類胚胎植入失敗的原因。我們在牛的數據與Lopes等人的發現大體一致，即能夠移植后懷孕的牛囊胚的氧氣消耗值在分布的中等范圍，并且氧氣消耗減少不利于胚胎存活力。HIGH SA和HIGH COMBI胚胎中氧氣消耗減少以及相同胚胎中丙酮酸和葡萄糖消耗的伴隨減少強烈表明氧化磷酸化速率下降。不尋常地，當前工作中所有囊胚從介質中移除顯著量乳酸，最可能由于我們培養基中僅存在于胎牛血清中的葡萄糖量低。當葡萄糖可用性低時，乳酸可作為替代能源并維持正常發育至囊胚階段。


出乎意料地，HIGH COMBI胚胎消耗的乳酸顯著多于對照胚胎。一種解釋可能是NEFA暴露導致細胞內氧化還原（REDOX）電位失衡，如先前報告。乳酸已被認為是小鼠卵母細胞中的強cytosolic還原劑，并因此可能被我們研究中的HIGH COMBI胚胎消耗，以在代謝應激面前作為REDOX調節劑。乳酸可通過乳酸脫氫酶（LDH）轉化為丙酮酸，然后可在轉化為草酰乙酸后進入三羧酸循環，伴隨NADH再生。或者，我們觀察到HIGH COMBI胚胎中丙氨酸產生升高。plausible that the excess in lactate-derived pyruvate may be converted preferentially in the cytosol to alanine by alanine aminotransferase.


這種REDOX狀態改變可能影響REDOX敏感轉錄因子的活性；例如，SLC2A1 mRNA量和REDOX狀態直接關聯。升高活性氧（ROS）濃度已知上調SLC2A1轉錄；我們在本研究中觀察到的模式。盡管SLC2A1表達增加，也稱為促進葡萄糖轉運蛋白1，HIGH COMBI胚胎中葡萄糖消耗無差異；確實，該組胚胎中未檢測到葡萄糖消耗。在缺乏葡萄糖攝取的情況下SCL2A1上調可能由SLC2A1蛋白生產失敗或葡萄糖轉運機制損傷引起。或者，HIGH COMBI胚胎中減少葡萄糖攝取可能考慮在葡萄糖：脂肪酸循環方面，在心臟細胞中，NEFA供應促進脂肪酸氧化并抑制葡萄糖氧化。


總之，我們的數據顯示，與卵母細胞成熟期間升高NEFA相關的母體代謝條件可能通過降低卵母細胞發育能力和后續胚胎存活力損害生育力。


在強調與肥胖相關的代謝問題及其與生育力下降的潛在關系時，我們的發現與公共衛生建議一致，這些建議強調女性在開始懷孕前保持健康體重的重要性。