囊胚的氨基酸譜分析

含有第7天囊胚的耗盡培養(yǎng)基的氨基酸含量通過(guò)反相HPLC測(cè)定，如先前描述。細(xì)節(jié)在材料和方法S1、S2、S3和表S1。

囊胚的氧氣消耗分析

個(gè)體囊胚受精后第7天加載到PCR玻璃微管（Drummond）中并允許呼吸30分鐘以形成氧氣梯度。該氧氣梯度使用微呼吸系統(tǒng)（Unisense）實(shí)時(shí)測(cè)量，并使用SensorTrace Pro（Unisense）轉(zhuǎn)換為氧氣消耗率，根據(jù)先前研究。

丙酮酸、乳酸和葡萄糖消耗

第7天囊胚在修改SOF培養(yǎng)基的4μl液滴中單獨(dú)培養(yǎng)3小時(shí)，alongside空對(duì)照液滴。孵育期后，移除胚胎并將耗盡培養(yǎng)液滴冷凍在-80°C直至分析。葡萄糖、乳酸和丙酮酸利用通過(guò)耗盡培養(yǎng)基的超熒光測(cè)定法測(cè)定，如先前描述。

統(tǒng)計(jì)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 15.0軟件（Windows系統(tǒng)，美國(guó)伊利諾伊州芝加哥市）進(jìn)行，除非另有說(shuō)明。采用二元邏輯回歸模型比較三種處理方式下的卵裂率和囊胚率。對(duì)于其他參數(shù)，采用混合模型方差分析法，將處理方式設(shè)為固定因素，重復(fù)實(shí)驗(yàn)設(shè)為隨機(jī)因素，以比較三組間的差異。除氨基酸代謝數(shù)據(jù)外，其他數(shù)據(jù)均無(wú)需進(jìn)行方差不等或正態(tài)性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。通過(guò)卡方檢驗(yàn)分析囊胚發(fā)育階段對(duì)氧氣、葡萄糖、丙酮酸及氨基酸譜的影響。相對(duì)轉(zhuǎn)錄本豐度分析采用SigmaStat（Jandel Scientific）軟件包，通過(guò)單因素方差分析結(jié)合Student Newman-Kleus多重比較法進(jìn)行事后檢驗(yàn)。

結(jié)果

在升高NEFA存在下成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育能力

在成熟培養(yǎng)基中補(bǔ)充不同NEFA組合對(duì)卵裂率無(wú)顯著影響，但基于比值比，在升高硬脂酸（HIGH SA）或補(bǔ)充升高硬脂酸（SA）、棕櫚酸（PA）和油酸（OA）濃度組合（HIGH COMBI）的培養(yǎng)基中成熟卵母細(xì)胞導(dǎo)致受精后第7天達(dá)到囊胚階段的卵母細(xì)胞數(shù)量顯著減少。HIGH COMBI處理還減少了形成囊胚的卵裂合子數(shù)量，與對(duì)照組相比。與對(duì)照組相比，HIGH SA組中卵裂合子成為囊胚的傾向較低。HIGH SA和HIGH COMBI暴露during maturation對(duì)發(fā)育能力的影響數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

由升高NEFA存在下成熟卵母細(xì)胞產(chǎn)生的牛囊胚的細(xì)胞數(shù)量和凋亡細(xì)胞指數(shù)

HIGH COMBI和HIGH SA組的總囊胚細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照組。此外，HIGH SA胚胎的凋亡細(xì)胞指數(shù)顯著高于對(duì)照組和HIGH COMBI胚胎。數(shù)據(jù)列于表1。

由升高NEFA存在下成熟卵母細(xì)胞產(chǎn)生的牛囊胚中關(guān)鍵基因的表達(dá)模式

我們接下來(lái)研究了囊胚中與凋亡、發(fā)育、質(zhì)量和代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)。出乎意料的是，許多這些基因的表達(dá)模式在由HIGH SA成熟卵母細(xì)胞產(chǎn)生的胚胎與對(duì)照組之間無(wú)差異。然而，這些數(shù)據(jù)表明DNA甲基化和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控存在差異；與對(duì)照組相比，來(lái)自HIGH COMBI條件下成熟卵母細(xì)胞的囊胚中DNMT3A和SLC2A1均上調(diào)。與對(duì)照組相比，在HIGH SA或HIGH COMBI條件下成熟的任一組中，IGF2R基因表達(dá)均上調(diào)。

來(lái)自NEFA暴露卵母細(xì)胞的囊胚的氨基酸代謝

如圖2A所示，與對(duì)照胚胎相比，來(lái)自在所有三種NEFA存在下成熟卵母細(xì)胞的囊胚顯示氨基酸消耗、產(chǎn)生和總周轉(zhuǎn)顯著升高。與對(duì)照胚胎相比，HIGH SA胚胎顯示氨基酸消耗和周轉(zhuǎn)顯著更高。

個(gè)別氨基酸的譜圖顯示，與對(duì)照和HIGH COMBI胚胎相比，含有來(lái)自HIGH SA卵母細(xì)胞的囊胚的培養(yǎng)介質(zhì)中絲氨酸、組氨酸和蘇氨酸的濃度顯著降低，而纈氨酸的消耗由HIGH COMBI囊胚更高。含有來(lái)自HIGH SA暴露卵母細(xì)胞的囊胚的介質(zhì)中甘氨酸濃度降低，表明甘氨酸消耗，而對(duì)照和HIGH COMBI胚胎顯示凈甘氨酸產(chǎn)生。卡方檢驗(yàn)顯示處理組間發(fā)育階段無(wú)顯著差異。因此，發(fā)育階段可排除為可能的混淆因素。

來(lái)自NEFA暴露卵母細(xì)胞的囊胚中ATP生產(chǎn)的關(guān)鍵過(guò)程

鑒于暴露卵母細(xì)胞于升高NEFA影響囊胚質(zhì)量、基因表達(dá)模式和氨基酸代謝的觀察，我們接下來(lái)研究了這些胚胎的氧氣消耗。使用非侵入性實(shí)時(shí)氧氣消耗測(cè)定，我們發(fā)現(xiàn)來(lái)自HIGH COMBI條件下成熟卵母細(xì)胞的囊胚消耗的氧氣顯著少于對(duì)照胚胎。HIGH SA組與對(duì)照組之間或HIGH SA與HIGH COMBI胚胎之間氧氣消耗無(wú)顯著差異。我們還測(cè)定了來(lái)自NEFA存在下成熟卵母細(xì)胞的囊胚對(duì)丙酮酸、葡萄糖和乳酸的消耗。與對(duì)照胚胎相比，HIGH COMBI胚胎消耗的丙酮酸和葡萄糖顯著較少。相比之下，HIGH COMBI胚胎消耗的乳酸顯著多于對(duì)照組。HIGH SA與對(duì)照胚胎之間丙酮酸、葡萄糖或乳酸消耗水平無(wú)顯著差異。卡方檢驗(yàn)顯示處理組間發(fā)育階段無(wú)顯著差異。因此，發(fā)育階段可排除為可能的混淆因素。