摘要


血清中非酯化脂肪酸（NEFA）濃度升高與肥胖、2型糖尿病等母體疾病相關，這種現象會改變卵巢卵泡微環境，并與因卵母細胞發育能力下降導致的不孕癥有關。本研究以奶牛為模型，探究卵母細胞成熟過程中NEFA濃度升高是否會影響由此形成的合子發育和生理功能。將合子培養至囊胚階段后，通過細胞數量、凋亡率、關鍵基因表達、氨基酸代謝及氧化代謝等指標評估其質量。結果顯示，在NEFA濃度升高的條件下，卵母細胞成熟形成的囊胚不僅細胞數量顯著減少，凋亡細胞比例增加，DNMT3A、IGF2R和SLC2A1基因的mRNA豐度也發生改變。此外，囊胚的氧氣、丙酮酸和葡萄糖消耗量降低，乳酸消耗量上調，氨基酸代謝水平升高。這些數據表明，成熟卵母細胞暴露于高濃度NEFA不僅會降低卵母細胞發育能力，還會通過損害早期胚胎質量、存活率和代謝功能，對生育能力產生負面影響。


引言


上調的脂解作用是代謝紊亂如肥胖和II型糖尿病的特征，導致血漿非酯化脂肪酸（NEFA）濃度增加。眾所周知，升高NEFA濃度對多種細胞類型具有細胞毒性，如Leydig細胞、神經生長因子分化細胞和肝細胞。此外，胰腺β細胞暴露于升高NEFA濃度會損害胰島素分泌，被認為是糖尿病發病機制中的重要因素。


使用牛模型，我們已證明升高血清NEFA濃度反映在排卵前卵巢濾泡的濾泡液中，并可直接影響顆粒細胞存活和類固醇生成，以及卵母細胞的發育能力。在人類中，飽和NEFA如棕櫚酸（PA）和硬脂酸（SA）以時間和劑量依賴的方式抑制顆粒細胞存活，這可能損害生育力。


流行病學研究表明，與脂解相關的母體代謝紊亂如肥胖和II型糖尿病是生殖障礙的潛在風險因素，這可能至少部分與早期妊娠丟失有關。因此，女性肥胖不僅增加流產風險，還損害輔助生殖技術的結局。


廣泛認為，適當的卵母細胞發育調控減數分裂、受精和早期卵裂的幾個關鍵步驟。此外，卵子發生期間的分子事件影響后續胚胎基因組的激活，表現在胚胎發生后期。然而，這些母體代謝紊亂與生育力下降之間的關系程度尚不清楚。


在本研究中，我們假設升高NEFA濃度是通過對卵母細胞的負面影響連接母體代謝紊亂和生育力下降的關鍵代謝因素。為此，我們使用牛卵母細胞體外培養模型研究牛卵母細胞成熟期間升高NEFA濃度是否影響后續胚胎表型。


我們報告，卵母細胞成熟期間升高NEFA濃度，特別是油酸（OA）、棕櫚酸（PA）和硬脂酸（SA），對由此產生的植入前胚胎有負面后果，在囊胚階段（8天后）測量。這些包括改變囊胚基因表達和降低胚胎質量，通過能量和氨基酸代謝（已知的胚胎存活力標記）確定。我們的數據提供了證據，表明由于卵母細胞成熟期間升高NEFA濃度，植入前胚胎出現代謝失調的機制，并有助于解釋患有代謝紊亂女性中較高的早期妊娠丟失和流產率。


方法


卵母成熟處理的組成


本研究使用的游離脂肪酸類型和濃度基于牛體內研究，并且是生理學適當的，因為患有脂解相關代謝紊亂（包括肥胖）女性中循環游離脂肪酸濃度與牛在脂解上調事件中檢測到的NEFA濃度非常相似。


標準無血清成熟系統缺乏脂肪酸，盡管卵母細胞在體內成熟的生理環境含有生理、基礎濃度的NEFA。為了改進我們體外模型的相關性，我們因此使用補充基礎NEFA濃度的成熟培養基作為對照培養基。我們顯示，在成熟培養基配方中包含生理濃度關鍵NEFA（三次重復；595卵母細胞）不影響發育能力，與標準無血清成熟培養基相比。


在初步實驗中，我們確定硬脂酸（SA）為對卵母細胞發育能力最有毒的NEFA。升高棕櫚酸（PA）濃度對發育能力的影響揭示與升高硬脂酸（SA）處理類似的發現，盡管較不顯著，支持我們先前研究的發現。升高油酸（OA）處理對發育能力無影響，也不影響總囊胚細胞數；僅囊胚凋亡細胞指數在OA處理during oocyte maturation后顯著升高。


對于額外實驗，我們因此聚焦于HIGH SA和HIGH COMBI處理。本研究中使用以下NEFA處理：


1.對照=生理NEFA濃度（150μM總NEFA，包括25μM SA、50μM PA和75μM OA）。


2.HIGH SA=升高硬脂酸濃度（75μM SA）。


3.HIGH COMBI=升高NEFA濃度組合（425μM總NEFA，包括75μM SA、150μM PA和200μM OA）。


NEFA處理的制備


所有化學品購自Sigma®，除非另有說明。SA、PA和OA溶解在純乙醇的儲備溶液中，濃度分別為25、150和200 mM。這些乙醇儲備溶液渦旋混合4分鐘，并在工作溶液中稀釋以獲得成熟培養基中所需最終濃度。無血清成熟培養基由TCM199組成，補充0.75%無脂肪酸BSA、0.4 mM谷氨酰胺、0.2 mM丙酮酸鈉、0.1 mM半胱胺、50 ug/mL慶大霉素和鼠表皮生長因子（mEGF，20 ng/ml）。所有處理劇烈搖動45分鐘并在無菌條件下過濾滅菌。


體外胚胎生產


體外生產程序如先前描述進行，使用屠宰后2小時內收集的母牛檢索的未成熟卵母細胞。細節參考材料和方法S1、S2、S3和表S1。


卵母細胞發育能力評估


卵裂（受精后2天）和囊胚率（受精后7天）定義為成熟卵母細胞中卵裂合子或形成囊胚的數量respectively。還記錄了卵裂合子中形成囊胚的數量。


囊胚細胞數量和凋亡細胞指數的測量


細胞數量和凋亡細胞指數（凋亡細胞數over總細胞數）通過用碘化丙啶（PI）和末端脫氧核苷酸轉移酶dUTP缺口末端標記（TUNEL）染色第7天正常和擴張囊胚評估，如描述。


囊胚RNA提取、逆轉錄和mRNA轉錄豐度定量


分子生物學程序如先前描述進行。