在黑暗中以10μm的垂直步長測量氧氣微剖面，從組織表面通過DBL進入體相水中，體相水具有恒定的氧氣含量。氧氣通量（暗呼吸速率）根據(jù)氧氣濃度剖面計算為：

J=Do*dC/dz(2)

其中Do是O2在27°C和鹽度35 ppt下的擴散系數(shù)，dC/dz是DBL中氧氣梯度的恒定斜率；該計算假設(shè)一維擴散幾何形狀。

在每個后續(xù)輻照度水平（33,59,91,130,247,494和845μmol光子m?2s?1）下，將微電極尖端定位在組織表面，當驗證穩(wěn)態(tài)氧氣條件后，執(zhí)行突然且短暫（1至3秒）的明暗轉(zhuǎn)換以估算總光合作用速率。明暗轉(zhuǎn)換技術(shù)需要在明暗轉(zhuǎn)換之前達到穩(wěn)態(tài)O2分布，從而能夠通過黑暗開始后氧氣立即消耗的速率來測量總光合作用速率。在總光合作用測量后，測量氧氣微剖面并用于通過公式2估算凈光合作用速率。最后，在每個輻照度水平下使用配備2毫米光纖探頭的Mini-PAM熒光計，通過單個飽和閃光讀取有效量子產(chǎn)量。將探頭輕輕手持在珊瑚表面，緊鄰O2微電極。這些測量用于生成相對電子傳輸速率與輻照度的穩(wěn)態(tài)光曲線。

使用Imaging-PAM在最高輻照度水平（845μmol光子m?2s?1）下重復(fù)初始RLC。為了維持PSII的高光適應(yīng)狀態(tài)，在將珊瑚放入Imaging-PAM后，開啟作用光（845μmol光子m?2s?1）1分鐘，然后啟動RLC。暗適應(yīng)RLC中的第一個飽和閃光提供了最大量子產(chǎn)量的測量值，該值與光適應(yīng)RLC的第一個測量值（提供了比較性的ΔF/Fm'）進行比較。然后計算PSII上的最大激發(fā)壓力為Qm=1-[(ΔF/Fm')/(Fv/Fm)]。Qm用作蟲黃藻生理性能的代理，接近0的值表明即使在高輻照度下光合作用也受光限制，而接近1的值表明在高輻照度下PSII關(guān)閉，例如由于光抑制。

從RLCs以及穩(wěn)態(tài)光曲線導(dǎo)出的rETR計算為rETR=ΔF/Fm'×PAR，其中ΔF/Fm'=(Fm'-Ft)/Fm'。隨后將光曲線（熒光和O2衍生）擬合到Platt等人的公式，從而計算rETRmax、α和Ek的定量參數(shù)。

使用單因素方差分析比較健康和褐帶組織之間RLCs和穩(wěn)態(tài)光曲線（熒光和O2衍生）的定量參數(shù)、PAR吸收率和葉綠素a含量的差異。當正態(tài)性和方差齊性假設(shè)失敗（P<0.05）時，使用自然對數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)；這僅適用于RLCs和SSLCs的rETRmax值。轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)成功滿足正態(tài)性和方差齊性假設(shè)。使用Tukey-Kramer honestly significant difference檢驗對RLCs和熒光衍生穩(wěn)態(tài)光曲線的定量參數(shù)進行事后比較。

結(jié)果

BrB的野外和顯微鏡觀察。BrB在野外表現(xiàn)出獨特的宏觀癥狀，這些癥狀源于纖毛蟲在珊瑚樣品外部滑動并進入珊瑚蟲的共體腔和腔體。纖毛蟲的光學顯微鏡分析表明纖毛蟲體內(nèi)積累了完整的蟲黃藻。攝入的蟲黃藻保持強烈的局部葉綠素自發(fā)熒光，表明葉綠體完整且具有潛在的光合作用能力。此外，取樣的褐帶物質(zhì)的組織學橫截面顯示，纖毛蟲含有完整的蟲黃藻，這些蟲黃藻沒有被食物液泡包圍。

可變?nèi)~綠素a熒光成像顯示褐帶組織具有高熒光以及高PAR吸收率，并且褐帶組織中的活躍光合作用通過最大量子產(chǎn)量明顯，該產(chǎn)量與健康組織相當或略高。

健康組織的PAR吸收率測量值顯著低于褐帶組織。然而，健康組織的葉綠素a含量與褐帶組織中發(fā)現(xiàn)的含量沒有顯著差異。這表明色素在健康組織和褐帶之間的分布不同。

可變?nèi)~綠素a熒光和O2生產(chǎn)力的聯(lián)合測量。熒光衍生的暗適應(yīng)和光適應(yīng)RLCs的最大量子產(chǎn)量和有效量子產(chǎn)量以及Qm如圖所示。Fv/Fm在健康組織和褐帶組織之間沒有變化。健康組織的ΔF/Fm'顯著低于褐帶組織。這種關(guān)系反映在隨后計算的PSII最大激發(fā)壓力Qm中，健康組織的Qm高于褐帶組織，盡管差異不顯著。

在暗處初始測量并在增加光照80分鐘后再次測量的RLCs的定量參數(shù)與熒光衍生SSLCs計算的rETRmax、α和Ek進行了統(tǒng)計學比較。為健康和褐帶組織的明適應(yīng)和暗適應(yīng)RLCs計算的rETRmax顯示出相似的值。然而，在暗適應(yīng)褐帶組織上執(zhí)行的RLC也與健康組織SSLCs計算的rETRmax共享相似的值，這些值顯著不同。為褐帶組織SSLCs計算的rETRmax與所有其他組織和光曲線類型組的值相似。rETR與輻照度曲線的斜率α在所有三組光曲線中的健康和褐帶組織之間顯示出相似的值。然而，在暗處執(zhí)行的RLCs顯示出顯著低于為SSLCs計算的α。在光處執(zhí)行的RLCs計算的α值與暗適應(yīng)RLCs和SSLCs的值相似。在光曲線組和組織類型之間，最小飽和輻照度Ek沒有顯著差異。

健康和褐帶組織在整個輻照度范圍內(nèi)表現(xiàn)出廣泛不同的O2濃度水平。在最高輻照度水平（845μmol光子m?2s?1），健康組織的O2濃度為223±4μmol liter?1，而褐帶組織的O2濃度為62±22μmol liter?1。這約占飽和O2濃度的30%。在黑暗中，健康組織的O2濃度為60±28μmol liter?1，但由于高呼吸活動加上DBL施加的O2傳輸限制，褐帶組織實際上為0（3±3μmol liter?1）。褐帶組織在低于60μmol光子m?2s?1的輻照度下幾乎完全缺氧，并且從未達到補償輻照度，即組織表現(xiàn)出凈氧氣產(chǎn)生以上的輻照度。健康組織在約230μmol光子m?2s?1達到補償輻照度。

表1.從暗適應(yīng)和光適應(yīng)RLCs以及SSLCs的擬合rETR導(dǎo)出的定量參數(shù)a

a rETRmax單位為任意單位；α和Ek單位為μmol光子m?2s?1。RLC后括號中的數(shù)字是應(yīng)用的輻照度（μmol光子m?2s?1）。給出健康和BrB組織的平均值（n=4）±標準誤。具有不同上標大寫字母的值顯著不同。NS，不顯著。

微電極測量通常顯示薄的DBL范圍從100到200μm，并且跨DBL有強烈的氧氣梯度。纖毛蟲的運動引起波動的氧氣信號，這導(dǎo)致我們的通量計算具有相對較高的變異性。黑暗中的氧氣呼吸速率在健康組織和褐帶組織之間顯著不同。補償輻照度，即組織表現(xiàn)出凈氧氣產(chǎn)生以上的輻照度，在健康組織中在130和247μmol光子m?2s?1之間達到。然而，在補償輻照度之外記錄的最大凈產(chǎn)量較低且變化很大。褐帶組織在所有輻照度下都表現(xiàn)出凈氧氣消耗，但消耗速率隨著輻照度增加而降低，在健康組織確定的Ec附近穩(wěn)定下來。

盡管由于強烈的呼吸作用，在褐帶組織中沒有測量到凈氧氣產(chǎn)生，但有大量的總光合作用。從擬合的總光合作用速率和輻照度曲線計算的定量參數(shù)之間沒有顯著差異。褐帶組織顯示出比健康組織更高的Pg,max，盡管差異不顯著。健康組織和褐帶組織在α或Ek方面沒有顯著差異。

表2.從擬合的總光合作用速率與輻照度曲線導(dǎo)出的定量參數(shù)

討論

BrB相關(guān)纖毛蟲中的完整蟲黃藻

關(guān)于珊瑚礁生物疾病的報告在過去二十年中大幅增加。日益頻繁和分布更廣的珊瑚疾病已被證明會改變珊瑚總豐度和物種多樣性。多種微生物，包括真菌、細菌、藍細菌和原生動物，已被證明與健康和患病珊瑚相關(guān)。BrB最近被描述為大堡礁上新發(fā)現(xiàn)的一種珊瑚疾病。BrB的獨特宏觀野外癥狀是珊瑚上形成一個褐色區(qū)域，棲息著高密度的能動但尚未鑒定的原生動物纖毛蟲。盡管在北大堡礁三個礁石上BrB的流行率相當?shù)停吹陀谡{(diào)查珊瑚群體總數(shù)的1%，對應(yīng)于每個調(diào)查礁石12至24例，但BrB的高傳播速率和有效傳播可能對珊瑚礁組合造成重大損害，從而產(chǎn)生巨大的生態(tài)影響。

盡管其他生物如細菌和硅藻也與受影響珊瑚的褐帶區(qū)域相關(guān)，但纖毛蟲和攝入的蟲黃藻占最大生物量。褐帶組織中纖毛蟲的光學顯微鏡顯示內(nèi)部蟲黃藻完整，具有強烈的葉綠素自發(fā)熒光，這支持了蟲黃藻具有光合能力的觀點。共生蟲黃藻的退化是細胞分裂和衰老過程中的常規(guī)過程。與退化相關(guān)的形態(tài)學變化特征為空泡化、類囊體解體和積累體增大。先前觀察到珊瑚中空泡化增加導(dǎo)致在綠激發(fā)光下共生體自發(fā)熒光喪失，但在本研究調(diào)查的被攝食蟲黃藻中未觀察到這一點。此外，纖毛蟲的組織學切片也顯示細胞胞口內(nèi)存在完整的蟲黃藻，并且沒有周圍的食物液泡，否則表明攝入的食物正在降解。我們的顯微鏡觀察因此清楚地表明，在BrB中，攝入的蟲黃藻不會迅速降解，并在纖毛蟲內(nèi)保持完整。