褐帶綜合征是一種新的珊瑚病害，其特征是大量尚未鑒定的纖毛蟲局部聚集，并以帶狀沿珊瑚枝遷移。本研究觀察到形態(tài)完整的蟲黃藻在纖毛蟲體內(nèi)大量存在（每個纖毛蟲內(nèi)含有超過50個甲藻）。通過微尺度氧氣測量、可變?nèi)~綠素a熒光分析以及顯微鏡觀察，證明纖毛蟲內(nèi)的蟲黃藻具有光合能力，并且在褐帶區(qū)域的發(fā)展過程中未受到損害。通過比較快速光曲線和穩(wěn)態(tài)光曲線的可變?nèi)~綠素a熒光測量，蟲黃藻的光適應顯示出相似的趨勢。穩(wěn)態(tài)光曲線的延長光照暴露導致光系統(tǒng)II的更高量子產(chǎn)量。褐帶組織表現(xiàn)出更高的光合有效輻射吸收率，表明由于纖毛蟲主導區(qū)域內(nèi)蟲黃藻密度更高，光吸收更有效。這導致含有蟲黃藻的纖毛蟲區(qū)域相對于健康珊瑚組織具有相對較高的總光合作用速率。在纖毛蟲內(nèi)觀察到具有光合活性的細胞內(nèi)蟲黃藻，表明后者可以從攝入的蟲黃藻產(chǎn)生的光合產(chǎn)物以及光合作用產(chǎn)生的氧氣中獲益，這緩解了densely populated褐帶組織中有氧呼吸的擴散限制。尚待證明蟲黃藻是與纖毛蟲形成穩(wěn)定的共生關系，還是在攝食珊瑚組織過程中被偶然吞入，然后在被消化和替換之前一段時間內(nèi)保持在纖毛蟲內(nèi)活躍。

一種新近發(fā)現(xiàn)的珊瑚疾病——褐帶綜合征首次在澳大利亞大堡礁南北區(qū)域的三個珊瑚科（Acroporidae,Pocilloporidae,Faviidae）中被描述。該綜合征的宏觀癥狀表現(xiàn)為珊瑚上出現(xiàn)一個褐色區(qū)域，前接健康組織，后接裸露的白色骨骼。有時，在褐帶和健康組織之間觀察到白色區(qū)域，可能包含白化組織和/或裸露的骨骼。對褐色區(qū)域的顯微鏡檢查揭示了大量未知的原生動物纖毛蟲的存在，這些纖毛蟲在細胞內(nèi)積累蟲黃藻，導致了所觀察綜合征的特征性褐色。觀察到纖毛蟲帶以快速速率（>5厘米/天）沿分枝珊瑚從基部向頂端遷移。纖毛蟲似乎在病灶界面攝食珊瑚組織，從珊瑚內(nèi)胚層積累共生甲藻，即蟲黃藻。然而，尚不清楚蟲黃藻在纖毛蟲體內(nèi)是否保持光合活性。

在本研究中，我們使用帶有Mini-和Imaging-PAM（脈沖振幅調(diào)制）儀器的可變?nèi)~綠素a熒光分析和飽和脈沖技術(shù)，獲得了光系統(tǒng)II的最大和有效量子產(chǎn)量的測量值，并推導出光合電子傳遞的測量值。這些測量與氧氣微電極相結(jié)合，以評估患有BrB的珊瑚蟲黃藻的光合能力。它們快速的響應時間、小的尖端直徑和極低的氧氣消耗意味著O2微電極能夠以優(yōu)于100μm的空間分辨率和>0.2至0.5秒的響應時間測量氧氣消耗的快速變化以及擴散邊界層的微剖面。

只有有限數(shù)量的研究檢查了珊瑚-原生動物關聯(lián)。在本研究中，我們比較了受影響的Acropora muricata珊瑚褐帶區(qū)域前健康組織內(nèi)的蟲黃藻和褐帶區(qū)域內(nèi)積累的纖毛蟲內(nèi)蟲黃藻的光合性能。結(jié)合直接顯微鏡和組織學觀察與光生理響應分析，以確定內(nèi)化蟲黃藻的能力。我們的結(jié)果表明，在褐帶區(qū)域積累的視覺健康的蟲黃藻的光合作用調(diào)節(jié)動力學（通過O2衍生測量顯示）與健康組織中的蟲黃藻相比發(fā)生了巨大改變。然而，光合作用能力似乎沒有改變。

材料與方法

采樣。2005年11月從大堡礁戴維斯礁（18°49.86′S,147°38.2′E）一個暴露的礁坪上采集表現(xiàn)出BrB癥狀的分枝珊瑚Acropora muricata樣本，并帶到湯斯維爾的澳大利亞海洋科學研究所設施進行進一步分析。

組織學和顯微鏡檢查。為了組織學檢查，從珊瑚枝上刮下包括纖毛蟲和珊瑚組織的褐帶物質(zhì)，并通過離心（1,000×g）濃縮，去除多余液體。樣品在Davidson's固定液中固定24小時，然后處理。所有樣品均切片（5μm）并使用常規(guī)組織學程序染色（Mayer's蘇木精和伊紅），并使用光學顯微鏡檢查。使用Zeiss Axioskop II顯微鏡進行顯微鏡可視化，圖像通過AxioCam MRC5高分辨率冷卻電荷耦合器件相機捕獲。使用鹵素燈作為入射光和Cy3濾光片組（HQCy3（激發(fā)，BP535/50 nm；二向色鏡，Q565 LP；發(fā)射，BP610/75 nm））獲得熒光圖像。

PAR吸收率和葉綠素a測定。Imaging-PAM通過組織表面反射的紅光（650 nm）與未吸收的近紅外光（780 nm）反射率的比率估算光合有效輻射吸收率，即被吸收的入射PAR分數(shù)：

Abs=1- (R/NIR)   (1)

該參數(shù)在每個重復珊瑚群落的健康組織和褐帶組織中進行測量。重要的是要注意，Abs通過表面反射估算光吸收。因此，高度色素沉著的組織表面將顯示出比色素分布更均勻或更深層組織的表面更高的吸收率，盡管總體葉綠素濃度可能相同。

從約1 cm2的健康和褐帶組織分別提取組織，在1 ml甲醇中提取2小時。提取物離心（15,000 rpm）2分鐘，將澄清的上清液與70:30（體積/體積）甲醇-28 mM四丁基乙酸銨水溶液（pH 6.5）按1:1混合。將5μl混合物樣品在室溫（21°C）下注入Phenomenex C8柱（3μm粒徑，50×4.6 mm）。在個人計算機接口的高效液相色譜系統(tǒng)上進行反相高效液相色譜分析。使用Empower Pro軟件進行系統(tǒng)控制、數(shù)據(jù)收集和積分。使用二元流動相系統(tǒng)，70:30（體積/體積）甲醇-28 mM四丁基乙酸銨水溶液（pH 6.5）（75至100%），在10分鐘內(nèi)分離色素。流速保持恒定在1 ml min?1。使用光電二極管陣列檢測器檢測葉綠素a，并通過與葉綠素a標準品的光譜比較確定色素身份。使用卡尺測量圓柱形和指尖大小的珊瑚塊（從中提取組織）的高度和半徑至最接近的毫米，并應用于計算圓柱體側(cè)表面積的公式。計算表面積時排除了頂部和底部，因為這些區(qū)域代表附著在群體上的區(qū)域，因此沒有表面組織。

可變?nèi)~綠素a熒光和O2生產(chǎn)力的聯(lián)合測量。為了評估蟲黃藻的光合活性，對來自不同珊瑚群體的三個或四個表現(xiàn)出BrB癥狀的Acropora muricata分枝進行了測量。對每個群體應用以下設置和測量順序：一次在距離病灶4至5厘米的無癥狀健康組織中進行，一次在褐帶區(qū)域的中心（最密集區(qū)域）進行。

使用Imaging-PAM熒光計在暗適應珊瑚上執(zhí)行初始快速光曲線，輻照度之間間隔10秒（0,1,73,144,365,515,690,911和1204μmol光子m?2s?1）。對于氧氣微電極測量，然后將珊瑚放入一個定制流動室（25×10×10 cm）中，循環(huán)來自儲水池的海水，流速約為1 cm s?1。儲水池包含約20升海水，并使用玻璃水族箱加熱器（100 W；Aqua One；Kong's International,Australia）保持在27±0.5°C。

將線性校準的O2微電極（通過記錄在空氣飽和海水和O2游離海水中的信號進行校準）以相對于光源25°的角度放置，同時使用解剖顯微鏡觀察珊瑚樣品。通過使用手動操作的微操縱器將微電極直接接觸珊瑚組織表面，測量信號通過皮安計在條帶圖表記錄器上記錄。使用帶有準直透鏡的光纖鎢鹵素光源照射珊瑚，該光源針對光傳感器進行了校準。每個輻照度（0,33,59,91,130,247,494和845μmol光子m?2s?1）應用10分鐘，以便在O2測量之前達到穩(wěn)態(tài)條件。在特定輻照度下達到穩(wěn)態(tài)時，O2傳輸、消耗和生產(chǎn)處于平衡狀態(tài)，并且隨著時間的推移檢測不到O2水平的變化。在調(diào)整輻照度后，在條帶圖表記錄器上監(jiān)測組織表面氧氣水平表明，10分鐘足以達到穩(wěn)態(tài)。